Все процедуры, связанные с животными, были проверены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом JoVE.
1. Выделение PBMC из цельной крови
ПРИМЕЧАНИЕ: Проведите эту процедуру в шкафу биобезопасности, используя стерильную технику и стерилизованное производителем оборудование.
- Осторожно влейте 10-15 мл цельной крови из гепаринизированных (антикоагулянтных) пробирок для сбора крови в стерильную коническую пробирку объемом 50 мл. При незначительных пролитиях крови протрите с помощью ддН2О и 70% EtOH с помощью чистящей салфетки.
- Разбавьте кровь в конической пробирке в соотношении 1:1 с помощью фосфатного буферного раствора (PBS 1x) pH 7,4. Следите за тем, чтобы максимальный общий объем не превышал 30 мл.
- Аккуратно перемешайте с помощью серологического дозатора, не допуская образования пузырьков.
заметка: НЕ перемешивайте, переворачивая пробирку, чтобы избежать скопления крови в колпачке и последующего просачивания во время центрифугирования.
- Добавьте 13 мл Ficoll-paque (см. таблицу материалов), в новую коническую пробирку емкостью 50 мл. Держите трубку вертикально на решетке.
- С помощью переводной пипетки возьмите разбавленную кровь, прикоснитесь наконечником переводной пипетки к внутренней стенке пробирки в верхней части. При медленном и постоянном давлении передавайте кровь по внутренней стенке трубки, образуя слой крови поверх слоя сахарозы. Проделывайте этот шаг несколько раз, пока не пройдет вся кровь.
- Плотно закройте пробирку и центрифугируйте пробирку при комнатной температуре в течение 30 минут при 700 x g в качающемся роторе со средним ускорением, установленным на 5, и замедлением, установленным на НОЛЬ.
- Медленно выньте пробирку и, не потревожив слои, отнесите ее обратно в шкаф биобезопасности.
- Осторожно соберите охристую оболочку (тонкий мутный белый слой), где расположены PBMC, помещенные между слоями PBS/плазмы и фиколла с помощью переводной пипетки. Избегайте сбора слоя сахарозы и не беспокойте слой эритроцитов.
- Переложите охристую шерсть в новую стерильную коническую пробирку объемом 50 мл. Может потребоваться несколько раз повторения шага 1.8 для сбора всех ПМЦ.
- Добавьте PBS pH 7,4 в пробирку с PBMC и заполните до отметки 45 мл. Тщательно встряхните трубку. Не делайте вихрей.
- Промывка 1: Центрифуга в течение 15 минут при 480 x g с максимальным ускорением и замедлением на 9. Наблюдайте за образованием гранул PBMCs на дне конической трубки.
- Вылейте PBS (надосадочную жидкость) в пластиковую стакан с 10 мл отбеливателя.
- Разрыхлите гранулу ячейки, осторожно «прижав» к волнистой поверхности (т.е. к пустой решетке). Не делайте вихрей.
- Добавьте в пробирку 25 мл свежего PBS pH 7,4. Если обрабатывается более одной пробирки, соедините гранулы вместе на этом этапе.
- Промывка 2: Центрифугируйте пробирку в течение 12 минут при 480 x g с максимальным ускорением и замедлением на 9.
- Вылейте PBS (надосадочную жидкость) в пластиковый стакан с небольшим количеством отбеливателя.
- Аккуратно «решетка» упирается в волнистую поверхность (т.е. пустую решетку). Не делайте вихрей.
- Добавьте в пробирку 25 мл свежего PBS.
- Извлеките 50 μл ячеек и переложите в микроцентрифужную пробирку для подсчета жизнеспособности.
- Добавьте равное количество (50 мкл) трипанового синего (краситель для жизнеспособности) и осторожно перемешайте пипеткой вверх и вниз.
- Выньте 10 мкл и перенесите его в гемоцитометр, чтобы проверить жизнеспособность клеток в мл. Запишите количество клеток/мл. Запишите количество клеток/мл.
- Выньте желаемое количество ячеек и центрифугируйте пробирку в течение 12 минут при 480 x g с максимальным ускорением и замедлением, установленными на 9.
- Сбросить PBS (надосадочную жидкость) в стакан с отбеливателем.
- Аккуратно «решетка» упирается в волнистую поверхность (т.е. пустую решетку). Добавьте в пробирку 80 μл PBS.
2. Создание слайда PBMC
- Поместите 80 μл клеток на предметное стекло микроскопа. Размажьте каплю с помощью другого предметного стекла или нанесите по 2 капли по 40 мкл на оба конца предметного стекла.
- Оставьте горку в шкафу биологической безопасности до полного высыхания. Подпишите слайд карандашом на матовой стороне.
3. Исправление образцов на слайдах
- Приготовьте фиксирующий раствор, смешав 0,5 мл 37% формальдегида с 4,5 мл 99% этанола.
- После того как предметные стекла высохнут, достаньте 2 мл свежеприготовленного фиксирующего раствора и вылейте его на предметное стекло так, чтобы была покрыта вся поверхность предметного стекла.
- Оставьте раствор на предметном стекле на 1 минуту. Промойте предметное стекло в течение 1 минуты водопроводной водой и дайте ему высохнуть на воздухе.
4. Создание раствора амилазы для негативного контроля
- Возьмите 0,25 г порошка амилазы и растворите в 50 мл дистиллированной воды. Налейте раствор в чистую 100 мл стакан.
- Погрузите предметное стекло в стакан так, чтобы половина предметного стекла получила обработку, а другая половина осталась необработанной, а затем инкубируйте в течение 15 минут при комнатной температуре (рис. 1C).
- Отметьте, с какой стороны предметного стекла проводится лечение амилазой. Нарисуйте на обратной стороне предметного стекла линию, обозначающую границу между лечением и контролем.
- Промойте предметные стекла с помощью ddH2O, чтобы удалить раствор амилазы, и дайте предметному стеклу высохнуть на воздухе.
5. Выполнение периодического окрашивания кислотой Шиффа (PAS) и визуализации
ПРИМЕЧАНИЕ: Реагенты PAS токсичны при вдыхании и вызывают коррозию, поэтому шаги необходимо выполнять в химическом вытяжном шкафу, а отходы должны быть правильно утилизированы в соответствии с институциональными рекомендациями.
- Поместите предметное стекло на плоскую поверхность и вылейте на образец 1,50-2,00 мл раствора периодической кислоты. Выдерживать 5 минут при комнатной температуре.
- Промойте горки в нескольких зарядах дистиллированной воды.
- Налейте на предметное стекло 1,50-2,00 мл реактива Шиффа и выдержите его при комнатной температуре в течение 15 минут.
- Промойте предметное стекло дистиллированной водой в течение 5 минут и дайте ему высохнуть на воздухе.
- Нанесите монтажный носитель объемом 10 мкл на предметное стекло и крышку с помощью двух маленьких покровных крышек или нанесите 50 μл и используйте одну большую защитную крышку.
- Нанесите прозрачный лак для ногтей по краям покровного стекла, дайте высохнуть на ночь.
6. Получение изображений с помощью бинокулярного светового микроскопа с использованием 100-кратного объектива
