Окрашивание кристаллическим фиолетовым цветом: метод визуализации устойчивых к лекарствам раковых клеток с помощью анализов на образование колоний

Аннотация

Источник: Mohr, L. et al., Создание моделей устойчивости клеток рака предстательной железы к антимитотическому агенту Docetaxel. J. Vis. Exp. (2017)

В этом видео мы демонстрируем анализ жизнеспособности клеток с использованием процедуры окрашивания кристаллическим фиолетовым цветом для химиотерапевтических резистентных к лекарствам раковых клеток.

Протокол

1. Функциональная характеристика приобретенной резистентности к доцетакселу методом анализа колониеобразования

ПРИМЕЧАНИЕ: В этом протоколе химиорезистентность оценивалась с использованием анализов на образование колоний. Альтернативные методы, используемые для оценки жизнеспособности клеток (т.е. анализы MTS), могут быть использованы на основе предпочтений исследователей.

1. В планшет помещают 2000 клеток (DU145 или 22Rv1, как родительские, так и устойчивые к доцетакселу) в 6-луночные планшеты, используя 2 мл среды на лунку.
2. Через 24 ч добавить возрастающие концентрации доцетаксела (родительские клетки: 0,25, 0,5, 1, 2,5 и 5 нМ; Ячейки DR: 50, 125, 250, 500 и 1000 нМ) для клеточных линий DU145 и 22Rv1. Добавляйте ДМСО только в одну лунку в качестве контроля в том же объеме, который используется для самой высокой дозы доцетаксела.
3. Через 72 ч аспирировать среду, содержащую препарат, и добавить свежую среду, не содержащую доцетаксела.
4. Инкубируйте планшеты в течение 1-2 недель, пока колонии не станут видны под микроскопом.
5. Чтобы окрасить колонии, аккуратно промойте их 2-3 мл PBS и инкубируйте с 2-3 мл кристаллического фиолетового раствора (0,1% мас./об. в 10% формалине) в течение 20 минут внутри вытяжного шкафа или вытяжного шкафа.
6. Удалите раствор для окрашивания и вымойте пластины с 2-3 мл H₂O, снимите H₂O и высушите пластины на воздухе.
7. Анализируйте результат, визуализируя лунки и вручную подсчитывая колонии с помощью маркера (чтобы не подсчитывать одни и те же колонии дважды) и представляйте процент жизнеспособности клеток на графике. Сделайте цифровые изображения пластин для представления рисунка (рисунок 1).

Результаты

Рисунок 1: Функциональная и фенотипическая характеристика моделей устойчивых к доцетакселу клеток. Репрезентативные анализы колониеобразования родительских и доцетаксел-резистентных клеток, обработанных указанными концентрациями доцетаксела в течение 72 ч. Процент колоний для каждой концентрации лечения представлен на приведенном графике. Эксперименты проводятся в трех экземплярах, и данные представляют собой среднее значение ± SD. ...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Элементы DU145	АТКС	ХТБ-81
Элементы 22Rv1	АТКС	ЦРЛ-2505
Доцетаксел	Селлек Кемикалс	С1148	в ДМСО (10 мМ)
6-луночные планшеты для культивирования тканей	сокол	353046
RPMI 1640 Средний	Gibco	11875093	Содержит 10% FBS и 1% пеницилина/стрептомицина
Тональный крем B Сыворотка для плода крупного рогатого скота	Близнецы	900208
1X Фосфатно-солевой буфер (PBS)	Корнинг	21-040-СМ
Кристальный фиолетовый	Сигма-Олдрич	С0775
10% раствор формалина	Сигма-Олдрич	HT501128