$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Приготовление геля
- Проведите SDS-PAGE с 4% - 12% гелями белка Bis-Tris (1 мм, 15-лунка) с использованием мини-гелевого резервуара, заполненного буфером 2-(N-морфолино)этансульфоновой кислоты (MES).
- Разбавьте образцы смесью дистиллированной воды, буфера додецилсульфата лития (LDS) и восстановителя проб.
- Загрузите на первую полосу удвоенное количество материала (10 μл), затем обычное количество материала (5 μл) и затем проведите серию двукратных разведений материала (13 разведений, от 2x до 8192x).
- Запустите гель при постоянном напряжении 200 В в течение 30 минут.
2. Фиксация геля
- После электрофореза погрузите гели в 100 мл раствора 40% этанола/10% уксусной кислоты на орбитальном вибростенде со скоростью 50 об/мин при комнатной температуре 2x (каждый на 30 минут) или на ночь при 4 °C.
- Промойте гели 3 х 10 мин каждый в сверхчистой воде в чистой емкости. Этап стирки имеет решающее значение. Если кислота из фиксирующего раствора не удаляется должным образом на стадии флуорогенного проявления, избыточный TPE-4TA будет активирован кислотой и приведет к сильной фоновой флуоресценции в геле.
3. Приготовление раствора AgNO3 и пропитка геля серебром
- Чтобы приготовить раствор AgNO3 (0,0001%) для пропитки, сначала растворите 0,01 г AgNO3 в 10 мл сверхчистой воды для приготовления 0,1% исходного раствора AgNO3. Затем добавьте 100 мкл 0,1% стокового раствора AgNO3 в 100 мл сверхчистой воды><, чтобы получить рабочий раствор.
заметка: Перед применением раствор AgNO3 следует хранить в темноте.
- Пропитать гель 100 мл рабочего раствора серебра в течение 1 ч на орбитальном шейкере при 50 об/мин в герметичной стеклянной емкости. Крайне важно выполнять серебряную пропитку под вытяжным шкафом, защищенным от света алюминиевой фольгой.
- Смойте гель сверхчистой водой (около 100 мл) в чистой емкости в течение 2 х 60 с.
4. Флуорогенное развитие геля
- Для приготовления исходного раствора красителя (0,1 мМ) добавьте 3,0 мг красителя TPE-4TA в 50 мл сверхчистой воды. Проработайте раствор ультразвуком в течение нескольких минут и добавьте немного раствора NaOH (например, 1 М), чтобы помочь растворить краситель.
- Проверьте флуоресценцию раствора под УФ-лампой с длиной волны 365 нм, чтобы убедиться в полном растворении молекулы красителя. Только слабые или неизлучающие растворы указывают на полное растворение.
заметка: Краситель TPE-4TA был синтезирован в соответствии с протоколом, недавно описанным Xie et al.Решение TPE-4TA очень стабильно и может храниться в темноте в течение нескольких месяцев.
- Для приготовления 100 мл раствора флуорогенного проявлятеля (10 мкМ) добавьте 10 мл стокового раствора TPE-4TA в 90 мл сверхчистой воды. Проверьте рН раствора с помощью рН-метра и настройте его на 7 - 9 с помощью раствора гидроксида натрия (1 мкМ).
- Переложите гель в чистую и герметичную емкость со 100 мл раствора флуорогенного проявлятеля. Убедитесь, что гель полностью погружен в раствор. Закройте контейнер. Накройте его от света и встряхните в течение ночи на орбитальном шейкере при 50 об/мин при комнатной температуре. В качестве альтернативы, стадию инкубации также можно сократить примерно до ~2 ч путем предварительного нагрева проявочного раствора AIE до 80 °C для окрашивания, а затем оставить его при комнатной температуре.
5. Удаление пятен и визуализация
- Переложите гель в чистую емкость и очистите его от пятен в 100 мл 10% этанола в течение 30 мин. <бр/>
заметка: Для смывания геля можно использовать только воду. Тем не менее, более эффективным по времени является использование 10% раствора этанола для отсадки. Это поможет сократить процесс задержания с часов до 30 минут.
- Смойте гель в ультрачистой воде в течение 5 минут.
- Визуализируйте гель в канале 365 нм или канале 302 нм с помощью машины для документирования геля.