Окрашивание липидными каплями личинок эноцитов дрозофилы: методика оценки накопления липидных капель в нормальных и стрессовых условиях с использованием красителя на основе BODIPY

Аннотация

Источник: Wei, C., et al., Диссекция и окрашивание липидными каплями эноцитов у личинок дрозофилы. J. Vis. Exp. (2019).

Это видео демонстрирует окрашивание липидных капель в личиночных эноцитах дрозофилы - гепатоцитоподобных клетках - с использованием липофильного флуоресцентного красителя на основе BODIPY. Эти клетки выступают в качестве модели для изучения липидного обмена во время развития и в ответ на стресс окружающей среды, такой как голодание.

Протокол

1. Лечение личинок от голодания

ПРИМЕЧАНИЕ: У личинок третьего возраста в эноцитах мало или вообще нет обнаруживаемых липидных капель при нормальных условиях питания, но многочисленные крупные липидные капли могут быть индуцированы в эноцитах в условиях стресса, таких как голодание. Для дальнейшей верификации этого метода необходимо провести предварительную обработку этих личинок, чтобы индуцировать биогенез липидных капель в эноцитах. Здесь в качестве парадигмы был выбран временной цикл голодания в 12 ч, 24 ч и 36 ч. В частности, короткий период голодания (например, 3 ч) достаточен для индуцирования обнаруживаемых липидных капель в эноцитах. Продолжительность голодания может варьироваться в зависимости от конкретных целей эксперимента и условий.

1. Сделайте камеры для голодания и контрольных процедур.
   1. Для камер для лечения голодания: поместите фильтровальную бумагу соответствующего размера в чашку Петри диаметром 6 см и пипеткой нанесите на нее 1 мл PBS.
   2. Для контрольных камер обработки: поместите 5 мл стандартной кукурузной муки Bloomington в чашку Петри.
2. С помощью шпателя аккуратно выкопайте верхний слой корма, содержащий личинок, которые все еще зарываются в пищу, и перенесите их в чашку Петри, наполненную 5 мл PBS. Аккуратно перемешайте личинки в PBS, чтобы удалить любые пищевые загрязнения с личинок и сделать их максимально чистыми.
3. С помощью небольшой кисти соберите 40 личинок третьего возраста такого же примерного размера. Отсортируйте их случайным образом в камеру голодания или контрольную камеру, по 20 личинок в каждой.
4. Поместите камеры в инкубатор при температуре 25 °C и влажности 60% и дайте развиться в течение 12 часов, 24 часов и 36 часов обработки><. ПРИМЕЧАНИЕ: Для личинок в камере голодания добавляйте 1 мл PBS каждые 12 часов, чтобы избежать обезвоживания личинок.

2. Вскрытие эноцитов

1. С помощью маленькой кисти выберите личинок соответствующего возраста (через 12 ч, 24 ч или 36 ч после обработки), затем переложите их в новую чашку Петри, наполненную 5 мл ледяного PBS для мыть><я. ПРИМЕЧАНИЕ: Повторите шаг 2.2 при работе с личинками в контрольной камере, чтобы удалить любые пищевые загрязнения.
2. Заполните диссекционную пластину ледяным PBS и с помощью щипцов аккуратно перенесите личинки в диссекционную пластину. Поместите диссекционную пластину под стереомикроскоп для следующего этапа диссекции.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Ледяная температура поможет замедлить движения личинок и облегчит вскрытие.
3. Переверните личинки вентральной стороной вверх и тыльной стороной вниз и аккуратно удерживайте на месте с помощью щипцов. Закрепите личинки на пластине для вскрытия, поместив штифт для вскрытия через глотку на переднем конце и другой штифт через дыхальце на заднем кон><це. ПРИМЕЧАНИЕ: Дорсальную сторону легче всего определить по наличию дорсальных стволов трахеи.
4. Используйте пружинные ножницы Vannas для надреза (продольно) через эпидермис от переднего к заднему концу.
5. Удалите внутренние ткани эпидермиса с помощью щипцов.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Необходимо соблюдать осторожность при удалении ветвей трахеи, чтобы избежать повреждения эноцитов, которые локализуются на внутренней поверхности эпидермиса.
6. С помощью щипцов извлеките рассекающие штифты и перенесите эпидермис в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл, заполненную PBS, на льду.
7. Продолжайте препарировать других личинок, следуя описанной выше процедуре.

3. Окрашивание липидными каплями

1. Инкубировать рассеченный эпидермис в фиксирующем буфере в течение 30 минут при комнатной температуре (ОТ) на ротаторе.
   заметка: Фиксирующий буфер содержит 4% параформальдегида (PFA) в PBS.
2. Снимите фиксирующий буфер, после чего быстро промойте. Чтобы выполнить быстрое промывание, добавьте 1 мл PBS at RT в трубку после удаления PFA, аккуратно восстановите суспендию тканей и выбросьте PBS.
   осторожность: Фиксирующий буфер содержит PFA, который вреден для здоровья человека. Важно правильно утилизировать фиксирующий буфер как опасные отходы.
3. Промойте образцы 3 раза в течение 5 минут каждый PBS, чтобы смыть все возможные остатки PFA.
4. Инкубировать эпидермис с помощью BODIPY 493/503 (1 мкг/мл; см. таблицу материалов) в течение 30 мин при РТ на ротаторе.
   заметка: Начиная с этого этапа, оберните микроцентрифужную пробирку куском алюминиевой фольги, чтобы защитить образцы от света и свести к минимуму возможное фотообесцвечивание.
5. Удалите раствор для окрашивания BODIPY 493/503 и промойте образцы 3 раза по 10 минут каждый PBS для полного удаления остатков красителей.

4. Монтаж и визуализация

1. Поместите 6 μл монтажной среды на чистое предметное стекло микроскопа.
   заметка: Монтажная среда используется для более длительного времени обнаружения благодаря своим свойствам защиты от выцветания.
2. С помощью щипцов захватите один эпидермис и аккуратно удалите остатки PBS салфеткой.
3. Поместите эпидермис в монтажную среду и отрегулируйте его ориентацию таким образом, чтобы его внутренняя поверхность, содержащая эноциты, находилась внизу, а внешняя поверхность — сверху.
4. Аккуратно наложите покровный стекло на эпидермис.
   заметка: При необходимости удалите излишнюю утечку монтажного материала из-под защитного стекла салфеткой. Для облегчения визуализации осторожно надавите щипцами на покровное стекло так, чтобы при наблюдении за предметным стеклом через микроскоп можно было легко визуализировать скопление эноцитов в одной плоскости. В качестве альтернативы целесообразно разрезать эпидермис на два полуэпидермиса по средней линии, чтобы избежать сворачивания всего эпидермиса при монтаже тканей.
5. Нанесите прозрачный лак для ногтей по краям покровного стекла для герметизации.
6. Поместите предметные стекла в светонепроницаемую коробку для образцов и дайте лаку для ногтей высохнуть при температуре RT, что может занять 5-10 минут.
7. Приступайте к микроскопическому анализу. Получение изображений с помощью конфокального микроскопа (увеличение 63x с оптимизированными настройками фильтра GFP или FITC, возбуждение = 488 нм, излучение = 503 нм) для получения чистых и чувствительных сигналов с минимальным фоном.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Центрифужная пробирка объемом 50 мл	Корнинг	430829	50 мл
Чашка Петри 6 см	Термо Фишер	150326	6 см
агар			Для корма от мух
Алюминиевая фольга	Н/Д	Н/Д	Защитите smaple от света
БОДИПЫ 493/503	Инвитроген	Д3922	Краситель для окрашивания липидными каплями
Конфокальный микроскоп	Лейка	Leica TSC SP5	Конфокальная визуализация
Кукурузный сироп			Для корма от мух
Кукурузной муки			Для корма от мух
Покровное покрытие	Цитоглас	10212424К	20 × 20 мм, толщина 0,13-0,17
Штифт для вскрытия	Н/Д	Н/Д
Пластина для вскрытия	Н/Д	Н/Д
фильтровальная бумага	Н/Д	Н/Д	Диаметр: 11 см
Фиксирующий буфер	Н/Д	Н/Д	4% параформальдегида (PFA) в 1x ПБС
Щипцы	Дюмон	11252-30	#5
инкубатор	Цзяннань	СПХ-380	Для муховодства
Микроцентрифужная пробирка	Аксиген	MCT-150-C	1,5 мл
Предметное стекло для микроскопии	Цитоглас	10127105П-Г
Монтажный материал	VECTASHIELDАнтифадное крепление Терпимая	Н-1000	Монтажная среда с защитой от выцветания
лак	PanEra	AAPR419	Запечатайте покровное стекло
кисть	Н/Д	Н/Д
ПБС	Н/Д	Н/Д	1x PBS (137 мМ NaCl, 2,7 мМ<бр/> KCl, 10 мМ Na_{2} HPO_{4} ,1,8 мМ<бр/> KH_{2} PO_{4}, pH 7,4)
вертушка	Лабораторные приборы Kylin-Bell	WH-986
резать ножницами	Смартдата Медикал	СР81	Весенние ножницы Vannas
Соевая мука			Для корма от мух
шпатель	Н/Д	Н/Д
Стандартный корм из кукурузной муки	Н/Д	Н/Д	Кодирование по стандарту Bloomington Рецепт еды из кукурузной муки
Стереомикроскоп	Лейка	Leica S6E	Для рассечения тканей
Протрите бумагу	Н/Д	Н/Д
дрожжи			Для корма от мух