$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Решение для окрашивания LCO
ПРИМЕЧАНИЕ: Если hFTAA приобретается у коммерческого поставщика, следуйте инструкциям продавца, а не разделу 1.
- Ресуспендируйте лиофилизированный hFTAA в 2 мМ NaOH для приготовления исходного раствора 1 мг/мл. Храните бульон в стеклянном флаконе при температуре 4 °C. Запас можно хранить в течение одного года.
- В день окрашивания приготовьте рабочий раствор, разбавив бульон 1:10 000 в фосфатно-солевом буфере (PBS).
2. Подготовка образцов тканей
ПРИМЕЧАНИЕ: Многие типы тканей могут быть визуализированы с использованием hFTAA в качестве амилоидного маркера. Примеры см. на рисунке 1. hFTAA чувствительна к конформации агрегатов. Поэтому окрашивание предпочтительно проводить на неразрушенных агрегатах без воздействия эпитопов. Оптимальное спектральное качество достигается в том случае, если фиксация тканей сведена к минимуму. Следовательно, предпочтение отдается свежезамороженному материалу, аккуратно зафиксированному в этаноле во время окрашивания. Тем не менее, можно обнаружить отложения амилоида также в ткани, которая была зафиксирована, например, формалином. hFTAA в целом хорошо проникает в ткани. Выберите толщину образца, совместимую с предполагаемым методом визуализации.
- Если формалин фиксирован, используются срезы, залитые парафином, депарафинизированные в ксилоле в течение ночи. Опустите секции в последовательные ванны с содержанием 99% этанола, 70% этанола, dH2O и PBS, по 10 минут в каждой. Дайте срезам ткани высохнуть в условиях окружающей среды. Внимание: Ксилол всегда обрабатывается в вытяжном шкафу для химических веществ. Ксилол и другие органические растворители вредны.
- Разморозьте криосекции при комнатной температуре. Зафиксируйте участки ткани в 10% формалине на ночь и увлажните их, погрузив в последовательные ванны с 99% этанолом, 70% этанолом, dH2O и PBS, по 10 минут в каждую. Дайте срезам ткани высохнуть в условиях окружающей среды.
- Добавьте капли рабочего раствора hFTAA (примерно 200 мкл) в срезы ткани, чтобы покрыть ее. Капля должна оставаться на месте за счет поверхностного натяжения. Выдерживать 30 минут при комнатной температуре для окрашивания.
- Смойте раствор для окрашивания 500 μL PBS с помощью пипетки, а затем погрузите предметное стекло в ванну PBS на 10 мин. Дайте секции высохнуть при температуре окружающей среды.
- Монтаж осуществляется с помощью флуоресцентной монтажной среды. Дайте монтажному материалу осесть на ночь.
Примечание: окрашивание hFTAA может быть выполнено в сочетании с другими методами окрашивания, такими как иммунофлюоресценция, клеточные или органелло-специфические маркеры и т. д. Чтобы выполнить совместное окрашивание, запустите выбранный вами полный протокол окрашивания и добавьте окрашивание hFTAA в конце, начиная с шага 2.2. Примеры см. на рисунке 2. Для иммунофлюоресценции предпочтительно выбирать вторичное антитело, которое возбуждается при длине волны 640 нм или выше. В этом диапазоне длин волн hFTAA не поглощает и, следовательно, не может возбуждаться и не флуоресцирует. Это гарантирует, что между hFTAA и антителами не будет обнаружено сквозного просачивания.
