Все процедуры, связанные с животными, были проверены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом JoVE.
1. Подготовка
- Создание специфичных для остеокластов мышей с делецией Raptor (Raptorfl/fl; Ctsk-cre, далее RapCtsk) путем скрещивания мышей Raptorfl/fl с мышами Ctsk-cre. В этом исследовании используйте мышей Raptorfl/fl в качестве контрольной группы WT.
- Имейте контейнер со льдом, чтобы сохранить изолированную кость.
- Приготовьте питательную среду.
- Приготовьте питательную среду α-MEM, добавив минимальную эссенциальную среду альфа (α-MEM) с 1x глутамином, пенициллин-стрептомицином и 10% сывороткой эмбриона телят.
- Готовят среду для индукции макрофагов костного мозга, состоящую из 50 мл среды α-MEM и М-КСФ в концентрации 20 нг/мл.
- Готовят среду индукции остеокластов, состоящую из M-CSF и RANKL в концентрации 20 нг/мл соответственно, в 50 мл среды α-MEM.
- Подготовьте следующие буферы перед окрашиванием TRAP.
- Приготовьте раствор фиксации, состоящий из 6,5 мл ацетона, 2,5 мл раствора цитрата и 0,8 мл 37% (об/об.) раствора формальдегида.
- Приготовьте раствор для окрашивания TRAP.
- Предварительно подогреть деионизированную воду до 37 °C.
- Добавьте 100 μл быстрого раствора основания граната GBC и 100 μл раствора нитрита натрия в микропробирку объемом 1,5 мл и перемешивайте путем мягкой инверсии в течение 30 с. Оставьте смесь постоять 2 минуты.
- Предварительно подогрейте 9 мл деионизированной воды до 37 °C. Добавьте 200 мкл диазотизированного раствора основания быстрого граната GBC с шага 1.4.2.2, 100 мкл раствора фосфата нафтола AS-BI, 400 мкл раствора ацетата и 200 мкл раствора тартрата.
- Раствор красящей смеси TRAP держать на водяной бане при температуре 37 °C.
2. Вскрытие (День-1)
- Усыпить 3 месячных самок мышей WT и RapCtsk с помощью CO2 отдельно. Выполняйте ингаляции сCO2 с помощью соответствующего оборудования обученным персоналом.
- Погрузите 6 мышей в стакан со 100 мл 75% этанола (об/об) на 5 минут, чтобы предотвратить бактериальное загрязнение, а затем поместите на доску для вскрытия в лежачем положении. Сделайте надрез по дистальному отделу большеберцовой кости по вертикали и рассеките кожу вдоль задней конечности офтальмологическими ножницами.
- Разрежьте ножницами суставную связку тазобедренного сустава и вывихните задние конечности от туловища.
- Разрежьте суставную связку коленного сустава и аккуратно отделите большеберцовую и бедренную кости от коленного сустава. Аккуратно удалите мягкие ткани ножницами.
- Поместите все кости одного генотипа одной мыши в каждую лунку шестилуночной пластины с 2 мл α-MEM на лед.
заметка: Чтобы сохранить жизнеспособность клеток, кость следует выдерживать в этих условиях менее 1 ч.
3. Изоляция (День-1)
- Заполните одну лунку шестилуночного планшета 75% этанолом (3 мл), а остальные 5 лунок средой α-MEM (3 мл).
- Поместить все кости одного генотипа в промывку этанолом на 15 с и промыть кости 5 раз средой α-MEM в течение 10 с каждый раз.
- Ножницами отрежьте эпифизы и введите иглу шприца диаметром 0,45 мм в костную полость и промойте костный мозг средой α-MEM в центрифужную пробирку объемом 50 мл.
- Промывайте костную полость тем же методом с другого конца кости. Повторите не менее двух раз, чтобы тщательно промыть костную полость, пока кость не станет бледной.
- Центрифугируйте костный мозг для получения клеточной гранулы при 800 x g и 4 °C в течение 5 мин. Аспирируйте надосадочную жидкость.
- Добавьте 3 мл буфера для лизиса эритроцитов в пробирку центрифуги и осторожно пипеткуйте, чтобы восстановить суспендию костного мозга. Держите пробирку центрифуги на льду в течение 8 минут, чтобы лизировать эритроциты.
- Добавьте 6 мл среды α-MEM в центрифужную пробирку, чтобы остановить лизис клеток. Центрифугируйте при 500 x g и 4 °C в течение 10 мин и аспирируйте надосадочную жидкость.
- Повторно суспендируйте в 3 мл питательной среды α-MEM и поместите клетки в шестилуночный планшет (обычно по одной мыши на лунку).
- Инкубировать при температуре 37 °C в инкубаторе с 5% содержаниемCO2 в течение ночи.
4. Покрытие (День 0)
- Перенесите надосадочную жидкость в центрифужную пробирку объемом 15 мл, чтобы на следующее утро собрать неприкрепленные клетки.
- Центрифугируйте при 800 x g и 4 °C в течение 5 минут и отсасывайте надосадочную жидкость.
- Ресуспендировать в 4 мл питательной среды α-MEM.
- Возьмите 20 μL раствора клетки и смешайте с 20 μL Trypan Blue. Добавьте 10 мкл смеси в счетную камеру и получите количество клеток на мл раствора.
- Добавьте соответствующий объем питательной среды α-MEM для получения клеточного раствора с концентрацией 500 000 клеток/мл.
- Добавьте по 500 мкл и 50 мкл среды для индукции макрофагов костного мозга в каждую лунку 24-луночного планшета и 96-луночного планшета соответственно.
- Добавьте 500 мкл и 50 мкл клеточного раствора в каждую лунку 24-луночного планшета и 96-луночного планшета соответственно.
- Инкубировать при температуре 37 °C в инкубаторе с 5% содержаниемCO2 в течение 3 дней.
5. Дифференциация (Дни 3-7)
- Через три дня после нанесения покрытия соберите по 50 мкл среды из каждой лунки 96-луночного планшета и заморозьте при -20 °C, а затем отаскайте остаточную среду.
- Добавьте 1 мл и 100 мкл среды для индукции остеокластов в каждую лунку 24-луночного планшета и 96-луночного планшета соответственно.
- Выдерживать при температуре 37 °C в течение 2 дней.
- Соберите по 50 мкл среды из каждой лунки и отсасывайте остаточную среду.
- Добавьте в каждую лунку среду для индукции остеокластов.
- Инкубировать при 37 °C в течение 1 суток.
заметка: На этом этапе крупные многоядерные остеокласты должны быть видны под перевернутым микроскопом (рис. 1А).
- Если остеокласты не видны, смените среду индукции остеокластов и наблюдайте ежедневно до тех пор, пока не появятся остеокласты.
- Соберите по 50 мкл среды из каждой лунки 96-луночного планшета после образования остеокластов.
6. Окрашивание тартрат-резистентной кислой фосфатазой (TRAP)
ПРИМЕЧАНИЕ: Зрелые остеокласты могут присутствовать после 6-7 дней культивирования in vitro (шаг 4).
- Отсадите medium и аккуратно промойте 3 раза 1x PBS.
- Зафиксируйте ячейки в каждой лунке 96-луночного планшета 100 мкл раствора фиксации на 30 с при комнатной температуре.
- После фиксации отасуньте раствор фиксатора и аккуратно промойте 3 раза деионизированной водой, предварительно подогретой до 37 °C. Аспиратируйте деионизированную воду.
- Добавьте по 100 мкл красителя TRAP в каждую лунку 96-луночного планшета и поместите планшет в инкубатор при температуре 37 °C на 30 минут и защитите от света.
- После окрашивания аспирируйте пятно TRAP и аккуратно промойте 3 раза деионизированной водой.
- Получение изображений остеокластов с помощью инвертированного микроскопа с 40-кратным увеличением.
