Окрашивание красным ализарином: метод визуализации минерализации культивируемыми остеобластами

Аннотация

Источник: Kampleitner, C., et al. профиль биологической совместимости биоматериалов для регенерации костей. J. Vis. Exp. (2018).

Это видео демонстрирует технику окрашивания для определения степени минерализации или отложения кальция в культивируемых первичных остеобластах с использованием красителя Alizarin Red.

Протокол

1. Минерализация остеобластов (OB) оценена путем окрашивания Alizarin Red S (ARS)

1. Добавьте первичные остеобласты (OB) к дискам с β-трикальцийфосфатом (β-TCP), используемым в качестве биосовместимого каркаса в культуральной тарелке.
2. Отсадите питательную среду из лунок, содержащих первичные ОВ, через 14 суток после добавления минерализующей среды и дважды промойте 0,5 мл 1x PBS при РТ. Отсадите PBS и зафиксируйте клетки, добавив 0,5 мл 10% буферизованного раствора формалина при РТ в течение 10 мин.
3. Отсадите 10% буферизованный формалин с помощью одноразовой пипетки и дважды промойте 0,5 мл сверхчистой воды.
4. К неподвижным ОБ добавьте 0,25 мл 40 мМ окрашивающего раствора ARS (pH 4,2), растворенного в сверхчистой воде, и инкубируйте планшет при RT в течение 10 мин на шейкере со скоростью 100 встрясок/мин.
5. Отсадите окрашивающий раствор с помощью одноразовой пипетки и промойте 1 мл сверхчистой воды. Повторите этот шаг 5–10 раз, чтобы удалить неспецифические пятна.
   заметка: Раствор для полоскания должен быть бесцветным.
6. Отсадите сверхчистую воду и добавьте 1 мл холодной PBS. Инкубируйте тарелку при RT в течение 10 минут на шейкере со скоростью 100 встряхиваний/мин.
7. Отсадите PBS, перенесите окрашенные диски β-TCP в новую скважину и отсканируйте пластины с помощью планшетного сканера для регистрации минерализации.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
β-трикальцийфосфатные диски (β-TCP, 14 мм)			Диски спекались в муфельной печи при температуре 1150 °С. Подробное описание производства можно найти в работе Zimmer et al (doi: 10.1002/jbm.a.34639). Образцы подвергали ультрафиолетовому облучению (по 15 мин с каждой стороны) перед использованием в клеточных культурах.
Пена Orthovita Vitoss (пена β-TCP/C)	Ортовита	2102-1405
Ализарин Ред С	Сигма-Олдрич	А5533
Раствор формалина нейтральный буферный 10%	Сигма-Олдрич	HT501128
Остеогенная среда минерализации (ММ)			α-MEM + 10% инактивированный при нагревании FBS + 1% пенициллин-стрептомицин + 50 мкг/мл аскорбиновой кислоты + 5 мМ β-глицерофосфат
Фосфатно-солевой буфер 1x (PBS) pH 7,4	Gibco, Thermo Fisher Scientific	10010023
Сверхчистая вода: Вода для клеточных культур не содержит пирогенов	ВВР	Л0970-500
Буфер для промывки			Добавьте 0,05% Tween20 к 1x PBS.
24-луночная суспензионная культуральная пластина	Грайнер биоуан	662102
Планшетный сканер: Epson Perfection 1200 Photo	Эпсон
Одноразовая пипетка: сывороточная пипетка	Грайнер биоуан	612301
Дистиллированная вода	Карл Рот	No 3478.4
Одноразовая пипетка: сывороточная пипетка	Грайнер биоуан	612301

гг. Кабель