$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Протокол окрашивания серебра
- Заранее приготовьте все растворы, необходимые для окрашивания серебра (табл. 1).<бр/>
заметка: Не прикасайтесь к гелю PAGE напрямую, пока он не окрасится, не проявится и не будет помещен в стоп-раствор. Вместо этого манипулируйте гелем с помощью чистых пластиковых или стеклянных инструментов. Непосредственное обращение с гелем приведет к искажениям отпечатков пальцев и другим видимым артефактам на геле после окрашивания.
- Как только прогон будет завершен, разберите кассету и извлеките гель в чистую емкость среднего размера, наполненную деионизированной, отфильтрованной водой.
заметка: Чтобы избежать прямого контакта с гелем, используйте наконечник пипетки или другой пластиковый предмет, чтобы аккуратно отсоединить гель от кассеты, погрузив его в воду. Гель может быть хрупким – обращайтесь с ним аккуратно.
- Слейте воду. Закрасьте гель в растворе для окрашивания алкийского синего в течение 5 минут.
- Выбросьте пятно от альцианского синего. Быстро промойте/промойте 2-3 раза деионизированной, фильтрованной водой, пока большая часть раствора для окрашивания алкийского синего не будет удалена.
- Дайте удалить пятна в деионизированной, отфильтрованной воде в течение ночи на коромысле. Убедитесь, что в геле достаточно деионизированной, отфильтрованной воды, чтобы любое остаточное пятно полностью смылось с геля за ночь.
- Смываем гель в 50% метаноле (всего 40 минут, смените раствор 2-3 раза).
- Смойте гель в деионизированной, отфильтрованной воде в течение 30 мин. Слейте воду и повторите еще 3 раза в общей сложности 2 часа, каждый раз заменяя воду.
- В свежей чистой емкости смочите гель на 30 минут в растворе для окрашивания нитрата серебра.
- Быстро промойте/промойте 2-3 раза в деионизированной, фильтрованной воде, чтобы полностью удалить раствор для окрашивания серебра.
- Промыть в течение 30 минут в деионизированной, фильтрованной воде. Слейте воду и повторите 2 раза в общей сложности 90 минут, каждый раз заменяя водяную баню.
- Слейте воду и добавьте развивающий раствор.
- Как только проявочный раствор будет добавлен, внимательно понаблюдайте за гелем и следите за появлением полос. В зависимости от качества окрашивания и массы загруженного образца, проявление может занять от нескольких секунд до нескольких минут.
- Как только будут видны нужные полосы, сразу же выбросьте проявляющий раствор и кратковременно промойте стоп-раствором.
- Выбросьте стопорный раствор, промойте и замените его свежим стоп-раствором. Дайте впитаться в течение 1 часа на коромысле или шейкере.
- Промойте в деионизированной, отфильтрованной воде на ночь (однако гель можно визуализировать сразу после остановки мытья раствором).
Таблица 1: Растворы, необходимые для окрашивания серебра гликозаминогликанами, разделенных электрофорезом в полиакриламидном геле. Все растворы перед применением должны быть отфильтрованы (0,22 мкм).
| ПРИМЕЧАНИЕ: Все растворы должны быть отфильтрованы (0,22 мкм) перед использованием. |
| решение | рецепт | состав | Комментарии |
| раствор для окрашивания в синий цвет Alcian (500 мл) | Порошок альцианского синего 8GX | 2,5 г | Желаемая концентрация: 0,5% по массовому объему |
| 2% v/v ледяной уксусной кислоты | 500 мл | |
| Серебряное пятно (200 мл) | Деионизированная вода | 192,7 мл | Приготовьте раствор для морилки в свежем виде, используйте в течение одной недели. |
| 7,6М гидроксид натрия | 2 мл | Для приготовления добавьте 3,04 г гранул гидроксида натрия в 10 мл воды |
| Гидроксид аммония | 3,3 мл | |
| Раствор нитрата серебра 4М | 2 мл | Для приготовления добавьте 3,397 г нитрата серебра в 5 мл воды. Добавляйте по каплям, помешивая, чтобы избежать выпадения осадков. |
| Разрабатываемое решение (501 мл) | Деионизированная вода | 500 мл | Проявочный раствор должен быть свежим и использован в течение 24 часов. |
| 2,5% по объему лимонной кислоты | 1 мл | Для приготовления добавьте 100 мг на 4 мл деионизированной воды. Лимонную кислоту необходимо делать свежей. |
| формальдегид | 250 мкл | |
| Стоп раствор (500 мл) | Деионизированная вода | 300 мл | |
| Ледяная уксусная кислота | 20 мл | |
| метанол | 90 мл | |