1. Посев для экспансионной клеточной культуры и планшетов с КОЕ
- Ресуспендируйте клетки (состоящие из эритроцитов и мононуклеарных клеток) в 50 мл базальной среды: альфа-МЕМ с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS), 100 ЕД/мл пенициллина, 100 мг/мл стрептомицина и 2,5 мг/мл амфотерицина В. Подсчитайте клетки, разведенные в соотношении 1:10 в растворе Трипана Блю с использованием камеры Нейбауэра.
- Поместите клетки в колбы для клеточных культур с плотностью 5 x 10⁷ клеток/см² и инкубируйте в увлажненном инкубаторе при температуре 37 °C. Если это возможно, используйте гипоксические условия (5% кислорода). Для контроля анализа КОЕ поместите 10⁹ клеток в чашку для клеточных культур диаметром 10 см.
- После 3 дней культивирования мезенхимальные стволовые клетки присоединяются к чашке для клеточной культуры, в то время как другие клетки остаются во взвешенном состоянии. Смените среду на базальную среду с добавлением основного фактора роста фибробластов (bFGF) 5 нг/мл. Для контроля анализа КОЕ аналогичным образом обрабатывайте чашку для клеточной культуры.
- Продолжайте культивирование клеток в общей сложности 2 недели, обмениваясь средами три раза в неделю. Если конфлюенция клеток превышает 80%, расщепляются путем трипсинизации. Для контроля анализа КОЕ также меняйте среды, но не разделяйте клетки в течение двух недель.
2. Окрашивание по Гимзе для анализа КОЕ
- Приготовьте 10 мл раствора Гимзы на блюдо: развести исходный раствор (7,6 г/л Гимзы в глицерин:метаноле) в соотношении 1:10 в стерильной воде (всегда готовьте свежий рабочий раствор).
- Удалите среду из чашки для клеточных культур и промойте клетки PBS. Будьте очень осторожны при нанесении жидкости на чашку Петри и избегайте смывания клеток.
- Зафиксируйте клетки в чистом метаноле в течение 5 минут на RT. Выбросьте метанол. Добавьте раствор Гимзы и инкубируйте в течение 60 минут во влажном инкубаторе при температуре 37 °C.
- Постирайте два раза с PBS. Высушите тарелку на воздухе головой вперед на бумажном полотенце. Подсчитайте колонии вручную. Лучше всего это достигается с помощью маркера на обратной стороне пластины.