$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
ПРИМЕЧАНИЕ: Аспираты костного мозга собаки из гребня подвздошной кости были собраны с согласия владельца собаки. Аспираты костного мозга собак (около 10 мл) противосворачивали путем добавления 15 мл 3,8% цитрата натрия сразу после вывода в операционной. Образцы были переданы в лабораторные условия для обработки в тот же день, что и изъяты.
1. Получение урокиназы (до1-го использования)
- Восстановите урокиназу с помощью стерильного фосфат-буферного физиологического раствора (PBS) в соответствии с инструкциями производителя: Добавьте 10 мл PBS в колбу с помощью шприца объемом 10 мл. Растворите сухое вещество путем закручивания до получения 50 000 инъекционных единиц (U) на мл.
- Приготовьте 500 мкл аликвот (25 000 ЕД каждая) в стерильные пробирки. Хранить аликвоты при температуре -20 °C и использовать при необходимости не менее 6 месяцев.
2. Подготовительные этапы (перед каждым лечением костного мозга)
- Разморозьте одну аликвоту урокиназы (25 000 ЕД) на свернувшийся аспират костного мозга (объем аспирата до 25 мл был успешно обработан с использованием одной аликвоты 25 000 ЕД).
- Разогрейте водяную баню или встряхивающий инкубатор до 37 °C.
3. Ферментативный расщепление тромба
- Выполняйте все работы в ламинарном проточном шкафу биобезопасности, чтобы избежать микробного загрязнения образцов костного мозга во время обработки. При работе с потенциально инфекционным человеческим материалом рекомендуется использовать защитные перчатки, а также соблюдать осторожность при обращении.
- Поместите клеточное ситечко размером 100 мкм поверх стерильной пробирки объемом 50 мл. Осторожно влейте аспират костного мозга через клеточное ситечко, наклоняя ситечко или перемещаясь вокруг материала сгустка. Используйте стерильный наконечник для дозатора для лучшего прохождения через фильтрующую сетку.
заметка: Избегайте разжижения сгустка, например, промывая сгусток PBS. Урокиназа действует опосредованно и требует компонентов сыворотки (т.е. плазминогена) из биопсии для эффективного переваривания. Продолжая процедуру с материалом тромба, фильтрат можно сохранять на RT до дальнейшего использования на шаге 3.6.
- Перенесите материал тромба костного мозга в пустую чашку для клеточной культуры с помощью стерильных щипцов. Разрежьте мусор на небольшие кусочки примерно по 2 мм3 с помощью стерильного скальпеля.
- Перенесите маленькие кусочки сгустка в реакционную пробирку объемом 50 мл с помощью стерильных щипцов. Следите за тем, чтобы измельченный сгусток имел влажный вид. Если он кажется сухим, используйте для увлажнения немного фильтрата из шага 3.1.
- Растирайте сгусток, пипетируя вверх и вниз 5 раз с помощью пипетки для микротитров объемом 5 мл. Добавьте к образцу 1 аликвоту урокиназы. Инкубировать в течение 30 мин при 37 °C либо на водяной бане, либо в встряхивающем (мягко) инкубаторе.
- Растирайте пипеткой вверх и вниз 5 раз с помощью пипетки объемом 5 мл. Выполните этот шаг в шкафу биобезопасности. Выдерживать еще 30 минут при температуре 37°C. После инкубации еще раз разотрите 5 раз, используя пипетку объемом 5 мл. Пропустите через свежее сетчатое фильтр 100 μм для сбора с фильтратом, начиная с шага 3.2.
- Центрифугируйте клеточную суспензию при температуре окружающей среды в течение 10 мин при 500 х г. Выбросьте надосадочную жидкость. Повторно суспендируйте клеточную гранулу в среде, как описано ниже, или в соответствии со стандартной процедурой вашей лаборатории для культивирования расширения МСК.
4. Посев для экспансионной клеточной культуры и планшетов с КОЕ
- Ресуспендируйте клетки (состоящие из эритроцитов и мононуклеарных клеток) в 50 мл базальной среды: альфа-МЕМ с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS), 100 ЕД/мл пенициллина, 100 мг/мл стрептомицина и 2,5 мг/мл амфотерицина В. Подсчитайте клетки, разведенные в соотношении 1:10 в растворе Трипана Блю с использованием камеры Нейбауэра.
- Поместите клетки в колбы для клеточных культур с плотностью 5 x 10 7 клеток/см2 и инкубируйте в увлажненном инкубаторе при 37 °C. Если это возможно, используйте гипоксические условия (5% кислорода). Для контрольного анализа КОЕ планшет 10 9 клеток помещают в чашку для клеточных культур диаметром 10 см.
- После 3 дней культивирования мезенхимальные стволовые клетки присоединяются к чашке для клеточной культуры, в то время как другие клетки остаются во взвешенном состоянии. Смените среду на базальную среду с добавлением основного фактора роста фибробластов (bFGF) 5 нг/мл. Для контроля анализа КОЕ аналогичным образом обрабатывайте чашку для клеточной культуры.
- Продолжайте культивирование клеток в общей сложности 2 недели, обмениваясь средами три раза в неделю. Если конфлюенция клеток превышает 80%, расщепляются путем трипсинизации. Для контроля анализа КОЕ также меняйте среды, но не разделяйте клетки в течение двух недель.
5. Дифференциация MSC
- Дифференциация МСК у собак
заметка: МСК у собак были дифференцированы на хондрогенные, остеогенные и адипогенные линии путем стимуляции соответствующими средами в течение четырех недель.
- Хондрогенная дифференциация
- Вырежьте кубики (по 3 мм с каждой стороны) из губчатого медицинского устройства, изготовленного из лиофилизированного коллагена типа I и используемого в качестве каркасного материала для поддержки клеток.
- Засейте МСК в верхней части кубиков в концентрации 4 x 106 клеток/мл (~70 000 клеток/куб).
- Перед добавлением среды дайте ячейкам прилипнуть к кубикам в течение 30 минут.
- Поддерживайте структуры МСК-коллагена в хондрогенных средах, состоящих из DMEM/F12 + GlutaMAX, 2,5 % FBS, 100 ЕД/мл пенициллина, 100 мг/мл стрептомицина, 2,5 мкг/мл амфотерицина B, 40 нг/мл дексаметазона, 50 мкг/мл 2-фосфата аскорбиновой кислоты, 50 мкг/мл L-пролина, 1x инсулин-трансферрин-селен X и 10 нг/мл трансформирующего фактора роста-β1.
- Используйте окрашивание alcian blue для визуализации накопления протеогликанов в сечениях конструкций. Кратко окрасьте срезы O/N 0,4% алцианского синего, растворенного в 0,01%Н2SO4 и 0,5М гидрохлорида гуанидина. Далее промыть срезы промывали в течение 30 мин в 40% ДМСО и 0,05М MgCl2. Клетки были компенсированы ядерным быстрым красным цветом.