Внутривенное окрашивание Судана: процедура окрашивания липид-насыщенных атеросклеротических бляшек в собранной дуге аорты мыши

Аннотация

Источник: Centa, M., et al. Количественная оценка атеросклероза у мышей. J. Vis. Exp. (2019)

Это видео демонстрирует процедуру с использованием суданского внутривенного окрашивания для окрашивания жировых отложений в собранной дуге аорты мыши для визуализации атеросклеротических бляшек и определения степени атеросклероза.

Протокол

Все процедуры, связанные с животными моделями, были проверены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом JoVE

1. Анализ дуги аорты и брахиоцефальной артерии en face

1. Подготовьте бутылочные ложа для анализа дуг аорты в лицо. Сложите отрезок парафиновой пленки в восемь раз, чтобы получилась плоская поверхность размером 25 мм x 25 мм. Обмотайте его черной электроизоляционной лентой, чтобы получился темный фон для аорты. Поместите этикетку на заднюю сторону стола для прикалывания и с помощью графитного карандаша напишите идентификационный номер мыши (обычные чернила ручки исчезнут в процессе окрашивания).
2. Перенесите дугу аорты на ложе для штырьков и положите на нее каплю PBS. Начните чистку аорты от оставшейся периадвентициальной жировой ткани под стереомикроскопом.
   1. Используйте ножницы Vannas и щипцы Дюмона, чтобы аккуратно удалить всю окружающую жировую ткань, не манипулируя и не повреждая аорту. Капельница Судана ярко окрашивает жировую ткань, и очень важно удалить всю такую ткань на этом этапе><. заметка: Постоянно поддерживайте аорту во влажном состоянии, при необходимости применяя дополнительные PBS.
3. Разрежьте аорту в корональной плоскости, введя ножницы Vannas в просвет аорты, чтобы обнажить интимную поверхность. Начните разрезать наружную кривизну восходящей дуги в дистальном направлении и продолжайте разрезать ветви, включая брахиоцефальную артерию. Пощадите дорсальную часть нисходящего грудного отдела.
   1. Разрежьте меньший изгиб и согните аорту, чтобы показать интимную поверхность><. заметка: Этот шаг требует мелкой моторики и некоторой практики для освоения.
4. Приколите открытую арку к ложу с помощью тупого конца мельчайших булавок от насекомых. Используйте микроиглодержатель Castroviejo, чтобы установить штифты на место. Аккуратно отогните штифты от образца, когда они будут на месте. Прикрепите аорту к ложу, не растягивая образец. Храните шарнирную арку вниз в чашке Петри, наполненной PBS при температуре 4 °C.
   заметка: Протокол можно поставить на паузу здесь.
5. Приготовьте рабочий раствор Судана IV. Смешайте 1 г порошка Sudan IV, 100 мл 70% этанола и 100 мл ацетона в темном флаконе и осторожно перемешивайте в течение 10 минут. Нет необходимости фильтровать раствор и его можно использовать в течение пары месяцев, если держать его в темноте при комнатной температуре. Если цвет окрашивания неудовлетворительный, можно найти новое решение и снова окрашивать образцы.
   осторожность: Ацетон является легковоспламеняющейся жидкостью, которая может вызвать серьезное раздражение глаз. Хранить в хорошо проветриваемом месте и соблюдать меры предосторожности при обращении.
6. Расставьте на лабораторном столе пять чашек Петри: одну с 70% этанолом, одну с рабочим раствором Sudan IV, две с 80% этанолом и одну с PBS.
   1. Начните с промывки образца в 70% этаноле в течение 5 минут, поместив прикалывающее стол в первую чашку Петри аркой вниз. Перенесите образец в рабочий раствор Sudan IV и дайте ему окрасить свод в течение 7 минут.
   2. Затем дважды прополощите в 80% этаноле в течение 3 минут, чтобы удалить пятна с нормальной интимной поверхности. Время удаления пятен может быть скорректировано для оптимизации результатов. Наконец, промойте в PBS, прежде чем поместить образец обратно в исходную чашку Петри.
7. Получение микрофотографий с помощью стереомикроскопа с 10-кратным увеличением, подключенного к цифровой камере. Сфотографируйте штифтовую арку, погруженную в PBS, с помощью небольших металлических грузов (20 мм x 10 мм x 5 мм), чтобы удерживать штифтовую кровать на дне чашки Петри.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Черная электроизоляционная лента (ширина 50 мм)	Любой специализированный розничный торговец		Для создания штифтовых лож для дуг аорты.
Ножницы для препарирования (10 см, прямые)	Мировые прецизионные приборы	14393	Для общего вскрытия органов.
Щипцы Dumont #5 (11 см, прямые)	Мировые прецизионные приборы	500341	Для микродиссекции аорты.
Этанол 70% (v/v)	VWR Химикаты	83801.29	Легковоспламеняющиеся жидкости и пары, хранить в хорошо проветриваемом месте и хранить в прохладе.
Абсолютный этанол ≥99,8%	VWR Химикаты	No 20821.31	Легковоспламеняющиеся жидкости и пары, хранить в хорошо проветриваемом месте и хранить в прохладе.
Формальдегид 4% стабилизированный, буферный (pH 7,0)	VWR Химикаты	9713.1 Телефон 9713.1	Вреден при вдыхании, при попадании на кожу и при проглатывании.
Изопропанол	Мерк	1096341011	Легковоспламеняющаяся жидкость, вызывает серьезное раздражение глаз и может вызвать сонливость или головокружение.
Иглодержатель Micro Castroviejo (9 см, прямой)	Мировые прецизионные приборы	503376	Для штыряния дуг аорты.
Булавки от насекомых Minutien, 0,10 мм	Инструменты для точной науки	26002-10	Для штыряния дуг аорты.
Парапленка М	Бемис	ПМ992	Парафиновая восковая пленка используется для создания штифтовых лож для дуг аорты.
Фосфатно-солевой буфер (PBS)	- T	- T	Для перфузии мышей требуется стерильный раствор, не содержащий РНКазы
Стереомикроскоп	Leica Microsystems	МЗ6	Для вскрытия и документирования по анфасу
Судан IV	Сигма-Олдрич	С4261	Не классифицируется как опасное вещество или смесь.
Ножницы Vannas (8 см, прямые)	Мировые прецизионные приборы	503378	Для микродиссекции аорты.

Сталь Кабель