$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Встраивание стебля
- Внесите в воду 7% раствор агарозы (7 г агарозы электрофорезного класса на 100 мл дистиллированной воды). Растворите агарозу путем автоклавирования в течение 20 минут или в микроволновой печи в течение 20 минут при минимальной интенсивности (например, 10% интенсивности микроволновой печи мощностью 1250 Вт).
- Подготовьте самодельную форму для заделки стеблей с помощью пластиковых флаконов.
- С помощью лезвия бритвы отрежьте коническое дно микроцентрифужной пробирки объемом 2 мл с завинчивающейся крышкой (часть А). Иглой шприца проколите отверстие в крышке трубки чуть больше диаметра вставляемого стебля. Затем отрежьте 0,5 см от дна микроцентрифужной пробирки объемом 0,6 мл (Часть В).
- Добавьте отрезную часть 0,5 см микроцентрифужной пробирки объемом 0,6 мл в предварительно отрезанную микроцентрифужную пробирку объемом 2 мл. Запечатайте две части с помощью парапленки (Рисунок 1).
заметка: Дно пробирки разрезается, чтобы облегчить извлечение внедренного образца после затвердевания агарозы. Отверстие в колпачке поможет удерживать стебель в устойчивом положении, когда стебель погружен в агарозу. Форма будет служить для удержания агарозы и удержания стебля прямо при заделке. Парапленка будет удерживать две части, А и В, до тех пор, пока агароза не застынет и стебель не будет встроен.
- С помощью бритвенного лезвия отрежьте часть стебля из интересующей области (например, середину первого междоузлия стебля).
заметка: В идеале стебель должен быть срезан непосредственно перед заделкой, чтобы избежать разрушения из-за обезвоживания. В качестве альтернативы стебель можно временно хранить в тарелке, содержащей фильтровальную бумагу, смоченную водой. Эту пластину можно положить на лед до тех пор, пока она не будет готова к внедрению, чтобы предотвратить обезвоживание и деформацию тканей. Хранение стебля дольше 30 минут без высокой влажности приведет к его высыханию.
- Растопите агарозу в микроволновой печи при низкой интенсивности.
осторожность: Флакон с агарозой может быть горячим. Возьмите бутылку с помощью рукавицы. Дайте расплавленной агарозе постоять при комнатной температуре (от 20 °C до 25 °C), пока она не остынет примерно до 50 °C.
- Медленно внесите пипеткой 5 мл агарозы в готовую пластиковую форму, чтобы заполнить флакон.
заметка: Следите за тем, чтобы в формочках не было пузырьков воздуха. Пузырьки воздуха вызовут зазоры в агарозной плесени и не полностью покроют образец стебля, что в конечном итоге приведет к неравномерному разрезанию участков образца.
- Дайте агарозе остыть в течение 30-60 секунд, чтобы она стала полутвердой. Проверьте маленькой зубочисткой, убедившись, что она может проникнуть и встать, но не всплыть в агарозе.
заметка: Если стебель будет помещен, когда агароза еще горячая, это повредит образец, сморщив стебель, разрушая морфологию клетки.
- Поместите стебель в этот флакон, наполненный агарозой. Следите за тем, чтобы стебель оставался прямым. Поместите перфорированный колпачок таким образом, чтобы кончик стебля удерживался колпачком. Не поворачивайте завинчивающуюся крышку. Иногда в один флакон может быть вложено более одного стержня (одного вида); Но в таком случае не используйте cap.
заметка: Если завинчивающуюся крышку повернуть, то стебель будет перекручен.
- Оставьте флакон при комнатной температуре или при 4 °C на 10-30 минут, пока он не застынет.
- Извлеките форму, аккуратно вытащив ее из трубки. Откройте парафильм. Осторожно надавите большим пальцем на дно части B формы, чтобы выпустить затвердевшую агарозу из части A на предметное стекло микроскопа.
- Разрежьте заделанный стебель агарозы на три примерно равные части по 1,2 см в длину. Вырежьте ту часть стебля, которой не было в агарозе и выбросьте ее.
- Храните эти кусочки агарозы со встроенными стеблями в герметичных микроцентрифужных пробирках объемом 2 мл в темной коробке при температуре 4 °C до тех пор, пока они не будут готовы к разрезу. В качестве альтернативы храните пробирки при температуре 4 °C не более одной недели.
заметка: Хранение возможно, но экспериментатор должен знать, что встроенные стебли все еще живы и, в зависимости от эксперимента, потенциально могут быть введены артефакты.
2. Секционирование стебля
ВНИМАНИЕ: Внимательно прочтите инструкцию по вибратому и следуйте всем инструкциям по технике безопасности.
- Убедитесь, что диск для образцов чистый и полностью сухой (без твердых или жидких веществ). Очистите диск с помощью бритвенного лезвия, чтобы удалить остатки клея от предыдущих экспериментов, и промойте водой. Затем обсушите бумажным полотенцем.<бр/>
заметка: Это обеспечит хорошую работу клея и его сцепление с агарозным экземпляром. Если этот шаг не выполнен должным образом, возможно, что образец не прилипнет к диску, что впоследствии приведет к тому, что образец отпадет от диска во время разрезания.
- Используйте мягкие бумажные салфетки, чтобы удалить влагу с агарозного блока, содержащего образцы.
- Нанесите небольшую каплю тканевого клея на диск с образцами. Нанесите клей, чтобы покрыть область в середине пластины с помощью кончика флакона с клеем. Быстро поместите агарозный блок так, чтобы образцы были либо перпендикулярны пластине, либо параллельно ей для поперечного или продольного сечений соответственно. Дайте клею зафиксировать образец на диске для образцов при комнатной температуре или при 4 °C в течение 10-30 мин. ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг зависит от времени.
- Закрепите диск с образцами на буферном лотке или желобе. Блок(и) агарозы с секциями должны находиться параллельно лезвию бритвы. Наполните буферный лоток дистиллированной водой комнатной температуры до полного погружения образцов.
- Разрежьте лезвие бритвы пополам, а затем обрежьте концы прочными ножницами так, чтобы лезвие оставалось полностью плоским. Прикрепите половину предварительно вырезанного лезвия бритвы к держателю ножа.
- Установите угол на держателе ножа на 84°, скорость на 0,90 мм/с (позиция 8 на вибратоме) и частоту на 50 Гц (позиция 5 на вибратоме). Вырежьте секции толщиной 100 мкм. Используйте непрерывный режим. заметка: Эта толщина была выбрана для того, чтобы гарантировать, что ткань может выдержать различные кислотные и щелочные обработки, используемые в некоторых протоколах окрашивания. Установите окно для секционирования и дайте 15-20 мин на непрерывном режиме, чтобы вибратомом рассек агарозный блок примерно 1,2 см.
- Соберите срезы с помощью одноразовой пластиковой пипетки во время разрезания в буферном лотке. В качестве альтернативы секции можно переложить из буферного лотка в стеклянный стакан, а затем в прозрачную пластину Петри. Переложите несколько секций в микроцентрифужные пробирки объемом 2,0 мл. Примечание: Образцы собираются из пластины Петри, потому что так легче увидеть срезы на четком фоне, а также потому, что буферный лоток может быть загрунтован для следующего образца.
- Секции можно хранить в пробирке объемом 50 мл или собирать и хранить в микроцентрифужных пробирках объемом от 1,5 до 2 мл при температуре 4 °C в течение 30–60 мин.<бр/>
заметка: Хранение разделов в течение более длительного времени приведет к ухудшению качества изображения.
3. Окрашивание Phloroglucinol-HCl (по Визнеру)
- Растворите 0,3 г флороглюцинола в 10 мл абсолютного этанола для получения 3% раствора флороглюцинола. Смешайте один объем концентрированного HCl (37 N) с двумя объемами 3% флороглюцинола в этаноле; этот раствор представляет собой флороглуцинол-HCl (Ph-HCl) или краситель Визнера.
заметка: Этот раствор должен быть свежим в день окрашивания и не может храниться, потому что раствор со временем испортится, и окрашивание станет неэффективным.
осторожность: HCl обладает высокой коррозионной стойкостью, поэтому будьте предельно осторожны при работе с пятном Ph-HCl.
- Переложите срезы стебля в микроцентрифужную пробирку объемом 2,0 мл. Добавьте 1 мл раствора Ph-HCl в пробирку, содержащую срезы, и немедленно закройте ее крышкой, потому что HCl в красилке Ph-HCl обладает высокой коррозионной активностью. Осторожно переместите трубку, чтобы убедиться, что все секции испачканы. Альтернативой этому шагу является удержание крышки пробирки открытой, чтобы раствор Ph-HCl можно было дозировать вверх и вниз, желательно без нарушения участков><.
заметка: Будьте осторожны и не вставляйте секции пипетки в наконечник пипетки, так как это может привести к их повреждению.
- Используйте пипетку объемом 1 мл с кончиком пипетки, обрезанным таким образом, чтобы срезы можно было легко отсоединить и не повредить их. Аккуратно нанесите пипетки на наконечник и на предметное стекло микроскопа. Накройте секции защитным накладкой. Наблюдайте за участками при яркопольном освещении. (Рисунок 2)
заметка: Раствор Ph-HCl высыхает за 5-10 минут, вызывая ухудшение состояния образцов. Следовательно, визуализация должна быть завершена в течение этого периода времени.
