Окрашивание маулы на лигнин: методика определения характеристик распределения лигнина в срезах стеблей Arabidopsis Thaliana

Аннотация

Источник: Pradhan Mitra, P. et al., Гистохимическое окрашивание вторичных элементов клеточной стенки Arabidopsis thaliana. J. Vis. Exp. (2014).

В этом видео мы описываем технику окрашивания Мауле для окрашивания сирингиллигнина, присутствующего в специализированных растительных клетках. Этот метод окрашивания помогает охарактеризовать распределение лигнина в ксилеме и межфасцикулярных волокнах.

Протокол

1. Окрашивание Mäule

1. Растворите 0,2 г марганцовки в 40 мл дистиллированной воды для приготовления 0,5% раствора марганцовки. Хранить в темной бутылке при комнатной температуре не более 7 дней.
   1. Приготовьте 3,7% раствор HCl, добавив 1 мл концентрированной HCl (37 N) в 9 мл дистиллированной воды (1:10). Приготовьте свежий 3,7% раствор HCl в день эксперимента. Убедитесь, что используемый стоковый раствор 37 N HCl не слишком старый. Концентрированный раствор гидроксида аммония (14,8 М) следует хранить при температуре 4 °С, чтобы предотвратить снижение молярности насыщенного раствора.
2. Переложите срезы стебля в микроцентрифужную пробирку объемом 2,0 мл. Добавьте 1 мл 0,5% раствора марганцовки в пробирку, содержащую срезы.
   Аккуратно подавайте
   1. пипеткой 0,5% раствор перманганата калия вверх и вниз, желательно не нарушая срезы. Инкубируйте в течение 2 минут и повторите пипетирование. Дайте микроцентрифужной трубке постоять, пока все секции не сядут.
      заметка: Будьте осторожны и не вставляйте секции пипетки в наконечник пипетки, так как они могут быть повреждены. Срезы стержня могут быть плохо видны, так как раствор темный, поэтому держите пробирку с секциями на штативе для пробирок и дайте им отстояться в течение 2 минут.
   2. С помощью пипетки объемом 1 мл наберите 700 мкл 0,5% раствора марганцовки. Добавьте 700 мкл дистиллированной воды, чтобы смыть раствор марганцовки. Повторите 3-4 раза или до тех пор, пока водный раствор не станет прозрачным.
   3. Слейте воду. Быстро добавьте 1 мл 3% HCl до тех пор, пока из срезов не выйдет темно-коричневый цвет. Это может произойти в течение 3-5 минут или может потребоваться 2 стирки по 5 минут каждое. Выведите пипеткой весь 3% раствор HCl и немедленно приступайте к следующему шагу.
   4. Добавьте 1 мл концентрированного раствора гидроксида аммония. Используйте пипетку объемом 1 мл с отрезанным кончиком таким образом, чтобы срезы можно было легко извлечь и не повредить их. Аккуратно нанесите пипетки на наконечник и на предметное стекло микроскопа. Накройте секции покровным стеклоподъемником. Наблюдайте за участками при яркопольном освещении. (Рисунок 1)
      осторожность: Поскольку гидроксид аммония чрезвычайно коррозичен, он требует особой осторожности и внимания, чтобы не вызвать коррозию на столешнице микроскопа или линзы><. заметка: Пары гидроксида аммония могут запотевать покровное стекло, что затрудняет наблюдение за образцом. Поэтому будьте особенно осторожны перед добавлением покровного стекла. Раствор высыхает за 5-10 минут, поэтому визуализация должна быть завершена за это время.

Результаты

Рисунок 1. Окрашивание Мяуле поперечных срезов стеблей A. thaliana. Окрашивание Mäule (красный цвет) на срезе стебля A. thaliana дикого типа, показывающее нормальное отложение лигнина в стенках межфасцикулярных волокон и ксилемных клеток (A-E). Указываются положения эпидермиса и коры головного мозга (Ep), межфасцикулярных волокон (Fi), сердцевины (Pi) и ксилемы (Xy). Увеличение: Панель А: 5X; Панель B: 10X; Панель C: 20X; Панели D и...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
агароза	EMD	MERC2125	Номер CAS: 9012-36-6
соляная кислота	EMD	НС0603-75	Номер CAS: 7647-01-0
Вибратом	Лейка	Микротом с вибрационным лезвием Leica VT1000S	http://www.leicabiosystems.com/ продукты/секция/вибролезвие-микротомы/детали/продукт/ leica-vt1000-s/
бритва	Американская компания по производству безопасных бритв	Товар # 60-0139-0000	Двухлезвийное лезвие из нержавеющей стали (Personna Super)
Микроцентрифужные пробирки с завинчивающейся крышкой (2 мл)	ВВР	16466-044
Микроцентрифужные пробирки (0,6 мл)	Аксиген Сайентифик	MCT-060-C
Тканевый клей	Тед Пелла Инк	10033	Хранить при температуре 4 °C или 20 °C в течение 3 месяцев и дольше
Фотоаппарат с ПЗС-чипом без механического затвора	Хамамацу	С4742-95
Программное обеспечение камеры	Молекулярные приборы	Версия MetaMorph 7.7.0.0
Воображаемый анаилсис	саман	Фотошоп CS4
Микро Чехол Бокал, Квадрат, No1	ВВР	48366-067	Защитные стекла 22 x 22 мм (7/8 x 7/8 дюйма) устойчивы к коррозии
Матовые микрослайды, 1 мм	ВВР	48312-003	75 x 25 мм - 1 мм
Гидроксид аммония	EMD	АХ1303-6	Номер CAS: 1336-21-6
Марганцовка	сигма	223468	Номер CAS 7722-64-7