Методическая статья

Очистка белков на основе аниообменной хроматографии: метод разделения для выделения представляющего интерес белка из диализованного бактериального лизата на основе чистого заряда

8 июля 2025 г.

В этой статье

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Источник: Fuehner, S., et al. Очистка S100A12 человека и его ион-индуцированных олигомеров для стимуляции иммунных клеток J. Vis. Exp. (2019)

В этом видео мы демонстрируем технику аниообменной хроматографии для очистки S100A12 человеческого кальций-связывающего белка на основе чистого поверхностного заряда белка из культуры Escherichia coli.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Очистка белка

  1. Анионообменная хроматография
    1. диализ
      1. Приготовьте буфер А для анионообменной хроматографии (AIEX) путем растворения 20 мМ Трис, 1 мМ ЭДТА и 1 мМ этиленгликоль-бис(2-аминоэтилэфир)-N, N, N', N'-тетрауксусной кислоты (ЭГТА) в деионизированной воде и отрегулируйте рН до 8,5 с помощью HCl. Для диализа приготовьте 2 x 5 л, а для хроматографии 2x 1 л буфера AIEX A.
        заметка: Объем диализата должен быть примерно в 100 раз больше объема образца. Все буферы, используемые для хроматографии, должны быть отфильтрованы (0,45 мкм или меньше) и дегазированы (например, с помощью ультразвуковой ванны или вакуумной дегазации).
      2. Разрежьте диализную трубку (отсечка по молекулярной массе [MWCO]: 3,5 кДа) на соответствующую длину с дополнительным пространством для воздуха, чтобы обеспечить плавучесть образца над вращающейся мешалкой.
        заметка: Глицерин сохраняет мембрану и должен быть удален перед использованием.
      3. Для снижения вязкости очищенного белкового раствора разбавьте раствор 25 мл буфера AIEX A для облегчения последующего нанесения на хроматографическую колонку. Прикрепите первое затвор к трубке, загрузите образец в мембрану и прикрепите второе затвор на расстоянии не менее 1 см от верхнего конца трубки.
      4. Поместите емкость объемом 5 л с буфером AIEX A на тарелку для перемешивания, добавьте мешалку и мембрану, заполненную белковым раствором. Отрегулируйте скорость вращения образца, избегая помех при вращении мешалки. Проводить диализ в течение 12−24 ч при 4 °C, затем заменить диализатный буфер (AIEX buffer A) свежим предварительно охлажденным препаратом и продолжать в течение еще не менее 4 часов. Переложите раствор диализованного белка в пробирку объемом 50 мл и профильтруйте через фильтрующую установку 0,45 мкм.
        заметка: Возможно хранение.
    2. хроматография
      1. Запустите систему жидкостной хроматографии (FPLC) с общего обслуживания, подключите колоночные буферы AIEX A и AIEX B (AIEX буфер A с 1 М NaCl) и колонку, содержащую анионообменную смолу. Общие хроматографические параметры см. в таблице 1.
        заметка: Буферы, колонка и оборудование FPLC должны быть уравновешены до одинаковой температуры перед началом прогона (см. хроматографические параметры в таблицах 1, 2).
      2. Уравновесьте колонку буфером AIEX A, затем загрузите образец на колонку и элюируйте белки линейным градиентом от 0% до 100% высокосолевого буфера (AIEX B). В таблице 2 приведен подробный протокол метода.
      3. Соберите 2 мл фракций во время элюирования и проанализируйте 10 мкл каждой фракции на электрофорезе в 15% полиакриламидном геле, окрашенном в Кумасси (SDS-PAGE). Объедините фракции S100A12 содержащие белок, для диализа.
        заметка: Молекулярная масса S100A12 составляет 10 575 Да.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Таблица 1: Подробная информация о применяемых параметрах аниообменной хроматографии.

Объем кровати (CV)75 мл
мониторАбсорбционная способность при 280 нМ
Максимальное давление3 бар
Буфер столбца A20 мМ Tris-HCl, 1 мМ ЭДТА, 1 мМ ЭГТА, pH 8,5

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
Конфликт интересов не декларируется.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
25% HCl  Карл Рот  X897.1
4− 20% протеиновые гели Mini-PROTEAN TGX  BioRad  4561093
Coomassie Briliant Blue R250 Раствор для удаления пятен  BioRad  1610438
Coomassie Briliant Blue R250 Раствор для окрашивания  BioRad  1610436
ЭДТА-дигидрат динатриевой соли  Карл Рот  8043.1
EGTA  Карл Рот  3054.3
Q Сефароза Быстрый Поток  GE Healthcare  17-0510-01  Смола для анионообменной хроматографии
Хлорид натрия (NaCl)  Карл Рот  3957.2
Гидроксид натрия  Карл Рот  P031.1
Tris Base  Карл Рот  4855.3
0.45 &микро; m шприцевой фильтр  Merck  SLHA033SS
5 л мерный стакан  Карл Рот  CKN3.1
50 мл конических центрифужных пробирок  Corning  430829
Закрытие диализных трубок  Спектр  132738
Фракционные коллекторные пробирки 5 мл  Грайнер  115101
Мембрана для диализа Spectra/Por (3,5 кДа)Spectrum  132724
Steritop  Merck  SCGPT01RE
ä Очиститель KTA UPC 10  GE Healthcare  Система FPLC
Сборщик фракций  GE Healthcare  Frac-920
Мини Тетра Клетка  BioRad  1658000EDU
НаноФотометр  Внедрить  P330
pH-метр  Ник  765

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

FPLC

Похожие статьи