Кальций-зависимая гидрофобная хроматография: метод очистки кальций-связывающих белков на основе гидрофобных взаимодействий

Аннотация

Источник: Fuehner, S., et al., Очистка S100A12 человека и его ион-индуцированных олигомеров для стимуляции иммунных клеток. J. Vis. Exp. (2019).

В этом видео мы демонстрируем очистку кальций-связывающего белка из диализованного клеточного лизата с помощью кальций-зависимой гидрофобной интерактивной хроматографии. Кальций-связывающие белки обнажают гидрофобную область при связывании с кальцием, облегчая взаимодействие с гидрофобной группой на смоле. Позже эти белки элюируются с помощью хелатора кальция ЭДТА, который обращает взаимодействие.

Протокол

1. Кальций-зависимая гидрофобная хроматография (HIC)

1. диализ
   1. Диализ белкового раствора против 20 мМ Трис, 140 мМ NaCl, pH 7,5
2. хроматография
   1. Приготовьте 1 л хроматографического буфера HIC A, растворив 20 мМ Tris, 140 мМ NaCl и 25 мМ CaCl2 в деионизированной воде, и отрегулируйте pH до 7,5. Для буфера HIC B растворите 20 мМ Tris, 140 мМ NaCl и 50 мМ ЭДТА. Отрегулируйте pH до 7,0, отфильтруйте и дегазируйте буферы. Добавьте в образец CaCl2 до конечной концентрации 25 мМ и отфильтруйте через 0,45 мкм. Уравновесьте буферы HIC и пробоотбор до 4 °C (температура колонки).
   2. Запустите систему жидкостной хроматографии с общего обслуживания, подключите колонковые буферы HIC A и B к колонке. Дополнительные хроматографические параметры см. в таблице 1.
   3. Уравновесьте колонку, загрузите образец и продлите блок «промывка несвязанного образца» до тех пор, пока УФ-сигнал снова не достигнет базового уровня. Затем начните элюирование с помощью буфера, содержащего хелататор кальция (ЭДТА). В таблице 2 приведен подробный протокол метода.
      заметка: Предыдущие эксперименты показали, что избыток кальция, по-видимому, полезен для связывания S100A12 с хроматографической смолой.
   4. Соберите пиковые фракции объемом 2 мл и проанализируйте 10 мкл каждой фракции на 15% SDS-PAGE, окрашенной в Кумасси. Объедините чистые фракции S100A12 и диализьте против буферизованного гелевым раствором (HBS; 20 мМ Hepes, 140 мМ NaCl, pH 7,0).
      заметка: Коэффициент экстинкции мономерного S100A12 составляет 2980 М-1 см-1
   .

Результаты

Таблица 1: Подробная информация о применяемых параметрах хроматографии гидрофобного взаимодействия.

блок	том	буфер	выход
равновесие	1−2 колоночные объемы (КВ)	a	отбросы
Загрузка образца

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
химический
ЭДТА дигидрат динатриевой соли	Карл Рот	8043.1 Материал 8043.1
Фенилсефароза Высокая эффективность	GE Healthcare	Тел.: 17-1082-01	Смола для хроматографии гидрофобного взаимодействия
Хлорид натрия (NaCl)	Карл Рот	3957.2 Кабельный терминал No 3957.2
Гидроксид натрия	Карл Рот	П031.1
База Трис	Карл Рот	4855.3
25% HCl	Карл Рот	Х897.1
Кальция хлорид дигидрат	Карл Рот	No 5239.1 Кабельный станок 5239.1
Лабораторная посуда
Шприцевой фильтр 0,45 мкм	Мерк	SLHA033SS
14 мл трубки с круглым дном	БД	352059
2 л фляга Эрленмайера	Карл Рот	LY98.1
Пробирки для сбора фракций 5 мл	Грейнер	115101
Диализная мембрана Spectra/POR (3,5 кДа)	спектр	132724
Фильтрующий блок Steritop	Мерк	SCGPT01RE
оборудование
Сборщик фракций	GE Healthcare	ГРП-920