Очистка белков на основе аффинной хроматографии никеля: метод очистки рекомбинантных белков, меченных полигистидином, от лизата бактериальных клеток

Аннотация

Источник: Pokhrel, A. et al. Анализ Очистка и активность in vitro для синтетазы (p)ppGpp из Clostridium difficile. J. Vis. Exp. (2018)

В этом видео мы демонстрируем технику аффинной хроматографии никеля для очистки помеченных гистидином ферментов пирофосфокиназы от бактерий Clostridium difficile.

Протокол

1. Очистка белка с помощью аффинной хроматографии никеля

1. Очистите белок с помощью 1 мл смолы никель-нитрилоуксусной кислоты (Ni-NTA) на гравитационной колонне.
   1. За день до применения уравновесьте колонку в течение ночи при 4 °C 2 мл уравновешивающего буфера (10 мМ Tris-HCl pH 7,79, 300 мМ NaCl, 50 мМ₂PO₄, 0,5 мг/мл лизоцима, 5 мМ MgCl₂, 10 мМ имидазола, 0,25 мМ DTT, 5 мМ фенилметансульфонилфторида (PMSF), 10% глицерина).
   2. На следующий день перед загрузкой осветленного лизата колонку доведите до температуры от 4 °C и дайте ей постоять ~2–3 ч.<бр/> заметка: Приведение колонны в тепловое равновесие имеет решающее значение для предотвращения образования пузырьков воздуха внутри колонны.
   3. Ресуспендировать гранулу в буфере для лизиса (10 мМ Tris-HCl pH 7,8, 300 мМ NaCl, 5 мМ MgCl₂, 50 мМ₂PO₄, 10% глицерин, 0,5 мг/мл лизоцима, 10 мМ имидазола, 0,25 мМ DTT и 5 мМ PMSF).
   4. Обрабатывайте клетки ультразвуком на льду с интервалом 8 х 10 с, делая паузу в 30 с между импульсами.
   5. Осветите лизат центрифугированием при 3080 x g в течение 30 мин при 4 °C с помощью микроцентрифуги.
   6. Приготовьте лизат с равными объемами буфера для лизиса, затем нанесите подготовленный осветленный лизат на колонку и соберите протекающий поток.
   7. Повторно нанесите осветленный лизат на колонку и соберите вторичный поток.
   8. Промыть колонку промывочным буфером 1 (10 мМ Tris-HCl (pH 7,79), 300 мМ NaCl, 5 мМ MgCl₂, 50 мМ₂PO₄, 30 мМ имидазолом, 10% глицерином). Соберите проточный.
      Примечание: Включение 5 мМ MgCl2 в буферы для промывки и элюирования важно для ферментативной активности очищенного белка.
   9. Промыть колонку промывочным буфером 2 (10 мМ Tris-HCl (pH 7,79), 300 мМ NaCl, 5 мМ MgCl₂, 50 мМ₂PO₄ и 50 мМ имидазолом).
   10. Соберите протекание.
   11. Нанесите 2 мл элюирующего буфера (10 мМ Tris-HCl (pH 7,79), 300 мМ NaCl, 50 мМ₂PO₄, 10% глицерин и 75 мМ имидазола). Соберите проточный поток в двух фракциях по 1 мл каждая.<бр/> заметка: Колонка после этого этапа может храниться в уравновешивающем буфере при температуре 4 °C, если тот же белок будет очищен в следующем анализе очистки. При правильном хранении колонку можно использовать до 3 раз.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Смола Ni-NTA	G Бионауки	786-940/941
Одноразовые гравитационные колонки Pierce, 10 мл	Термо Сайентиал	No 29924
Диализный аппарат Spectra/ Por float-A-lyzer G2 объемом 1 мл (MWCO: 20-kD)	спектр	G235033
Ультразвуковой процессор	Соники	ВК-750
Микроцентрифуга с ротором D3024/D3024R	Scilogex