$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Все процедуры, связанные с животными, были проверены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом JoVE.
1. Извлечение общего количества нековалентно-связанных липидов из микобактерий (Рисунок 1)
- Измельчите 0,2 г микобактерий из твердой среды и добавьте в стеклянную пробирку с полиэтиленфторэтленом (ПТФЭ) завинчивающиеся крышки. Добавьте раствор, состоящий из 5 мл хлороформа и 10 мл метанола (хлороформ:метанол, 1:2).<бр />
заметка: При использовании органических растворителей следует использовать только стеклянный ресивер. Пластиковые контейнеры запрещены. Кроме того, необходимы завинчивающиеся крышки с вкладышем из ПТФЭ для бутылок.
осторожность: Хлороформ является потенциально токсичным и чрезвычайно опасным веществом. Его необходимо использовать в капюшоне с ламинарным потоком при ношении соответствующих средств индивидуальной защиты (лабораторный халат, защитные очки и нитриловые перчатки).<бр />
осторожность: Метанол является потенциально токсичным и чрезвычайно опасным веществом. Его необходимо использовать в капюшоне с ламинарным потоком в соответствующих средствах индивидуальной защиты (лабораторный халат, защитные очки и нитриловые перчатки).
- Оставьте пробирку при постоянном перемешивании на ночь, чтобы извлечь нековалентные липиды с поверхности клеток микобактерий.
заметка: Если платформа для орбитального встряхивания недоступна, постоянное перемешивание можно заменить периодическим ручным перемешиванием как можно чаще.
- Накройте стеклянную воронку фильтровальной бумагой, отфильтруйте органические растворители и соберите их в стеклянную трубку.
- Используйте газообразный поток азота для испарения жидкой фазы в трубке. Наполните трубку газообразным азотом, накройте крышкой и храните при температуре 4 °C.
заметка: Подсоедините стеклянную пастеровскую пипетку к потоку газообразного азота, чтобы целенаправленно испарить нужную трубку. Кроме того, поддерживайте температуру трубки внутри нагревателя сухих блоков для трубок при температуре 37 °C. Когда растворитель испарится, заполните трубку газообразным азотом перед ее закрытием.
- Добавьте 15 мл раствора хлороформа:метанола (2:1) к клеточному мусору. Оставьте пробирку при постоянном перемешивании на ночь, чтобы извлечь нековалентные липиды с поверхности клеток микобактерий.
заметка: Если платформа для орбитального встряхивания недоступна, постоянное перемешивание можно заменить периодическим ручным перемешиванием как можно чаще.
- Дайте смеси отдохнуть в течение 1 ч. С помощью пипетки Пастера восстановите органические растворители. Накройте стеклянную воронку фильтровальной бумагой, отфильтруйте органические растворители и соберите их в ту же стеклянную трубку, которая ранее использовалась в шаге 1.3. Используйте газообразный поток азота для испарения жидкой фазы в трубке. Заполните пробирку газообразным азотом, закройте ее и снова храните при температуре 4 °C.
2. Экстракция миколиевой кислоты кислотным метанолизом (Рисунок 2A)
- Добавьте 2-5 мл этерифицирующего раствора в герметичную стеклянную пробирку с завинчивающейся крышкой из фторопласта. Добавьте в стеклянную пробирку 0,2 г биомассы микобактерий.<бр/>
заметка: Этерифицирующий раствор получают путем смешивания 30 мл метанола, 15 мл толуола и 1 мл серной кислоты. Клетки микобактерий могут быть взяты из твердых культур или даже из делипидатированных клеток после экстракции общих нековалентных липидов из микобактерий (оставшихся клеток после фильтрации на этапе 1.6).
осторожность: Толуол является легковоспламеняющимся и чрезвычайно опасным веществом. Его необходимо использовать в капюшоне с ламинарным потоком при ношении соответствующих средств индивидуальной защиты (лабораторный халат, защитные очки и нитриловые перчатки).<бр />
осторожность: Серная кислота является коррозионным и опасным веществом. Его необходимо использовать в капюшоне с ламинарным потоком в соответствующих средствах индивидуальной защиты (лабораторный халат, защитные очки и нитриловые перчатки).
- Перемешайте содержимое путем вортексинга. Дайте смеси постоять в сухой ванне при температуре 80 °C на ночь.
- Дайте пробирке остыть, пока она не достигнет комнатной температуры, а затем добавьте в пробирку 2 мл н-гексана. Перемешайте содержимое путем вортекса в течение 30 с и дайте пробирке отстояться, пока не появятся две прозрачные фазы.
ВНИМАНИЕ: н-гексан является потенциально легковоспламеняющимся, раздражающим, наносящим вред окружающей среде и чрезвычайно опасным веществом. Его необходимо использовать в капюшоне с ламинарным потоком в соответствующих средствах индивидуальной защиты (лабораторный халат, защитные очки и нитриловые перчатки).
- Восстановите верхнюю фазу, соответствующую н-гексановой фазе. Переложите его в новую пробирку.
- Повторите шаг 2.3. Снова восстановите верхнюю фазу и перенесите ее в ту же пробирку, которая использовалась в шаге 2.4.
- Испарить содержимое трубки с помощью газообразного флюса азота. Заполните пробирку газообразным азотом, закройте ее и храните при температуре 4 °C.
3. Экстракция миколовой кислоты методом омыления и метилирования (Рисунок 2B)
- Соскребите 0,2 г микобактерий с твердой среды и добавьте в стеклянную пробирку с завинчивающейся крышкой из ПТФЭ.
- Добавьте 2 мл метанол-бензольного раствора (80:20), содержащего 5% гидроксида калия. Перемешайте содержимое путем вортексинга. Нагрейте смесь в течение 3 часов при 100 °C.
осторожность: Бензол является легковоспламеняющимся, канцерогенным и опасным веществом. Его необходимо использовать в капюшоне с ламинарным потоком в соответствующих средствах индивидуальной защиты (лабораторный халат, защитные очки и нитриловые перчатки).
- Дайте трубке остыть до комнатной температуры. Добавьте 20% серной кислоты для подкисления образцов до достижения pH = 1.
- Добавьте 3 мл диэтилового эфира. Аккуратно перемешайте содержимое вортексом.
- Дайте двум фазам сформироваться, оседая. Восстановите фазу диэтилового эфира и переложите в новую трубку. Повторите этап стирки в общей сложности три раза.
- Промойте экстракт диэтилового эфира 2 мл дистиллированной воды и перенесите верхнюю часть, соответствующую диэтиловому эфиру, в новую пробирку. Повторите этап стирки в общей сложности три раза.
- Добавьте 2 г безводного сульфата натрия поверх экстракта диэтилового эфира, чтобы высушить его.
- Отфильтруйте суспензию. Выпарить содержимое с помощью газообразного флюса азота.
- Чтобы выполнить стадию метилирования, растворите 3 г N-нитрозо-N-метиловой мочевины в предварительно охлажденном растворе, образованном 45 мл диэтилового эфира и 9 мл 40% KOH в дистиллированной воде.
осторожность: N-нитрозо-N-метилмочевина является токсичным, раздражающим, канцерогенным и опасным веществом. Его необходимо использовать в капюшоне с ламинарным потоком в соответствующих средствах индивидуальной защиты (лабораторный халат, защитные очки и нитриловые перчатки).
- Переложите надосадочную жидкость (диазометан) в новую колбу, охлажденную во льду, содержащую гранулы гидроксида калия (примерно 30 г).<бр/>
заметка: Если надосадочная жидкость не используется сразу, ее можно хранить при температуре -20 °C не более 1 ч.<бр/>
осторожность: Гранулы гидроксида калия являются раздражающим и коррозионным веществом. Этот материал должен быть использован в капюшоне с ламинарным потоком при ношении соответствующих средств индивидуальной защиты (лабораторный халат, защитные очки и нитриловые перчатки).
осторожность: Диазометан очень токсичен и потенциально взрывоопасен. Его необходимо использовать в капюшоне с ламинарным потоком и безопасным стеклом, а также в соответствующих средствах индивидуальной защиты (лабораторном халате, защитных очках и нитриловых перчатках).
- Добавьте 2 мл эфирного раствора, содержащего диазометан, полученный на шаге 3.10, в высушенный экстракт диэтилового эфира, содержащий миколовые кислоты, полученный на шаге 3.8. Выдерживать 15 минут при комнатной температуре.
- Выпарите суспензию при 40 °C. Заполните пробирку газообразным азотом, закройте ее и храните метилированные липиды при температуре 4 °C.
заметка: Выпаривайте диазометан из раствора эфира под ламинарным проточным колпаком, пока эфир не потеряет желтый цвет.
4. Анализ тонкослойной хроматографии (TLC)
- Пропитайте стекло ТПК камеры. Для этого накройте одну из стенок камеры TLC листом фильтровальной бумаги и дайте ей соприкоснуться с подвижной фазой, состоящей из смеси растворителей. Поместите оставшийся объем растворителя на дно камеры TLC.
заметка: Дно камеры TLC должно быть покрыто не менее чем 1 см подвижной фазы. В настоящих экспериментах для разработки ТСХ использовались различные подвижные фазы. Они состояли из 85 мл н-гексана и 15 мл диэтилового эфира; 100 мл дихлорметана; 90 мл хлороформа, 10 мл метанола и 1 мл воды; 30 мл хлороформа, плюс 8 мл метанола и 1 мл воды; 60 мл хлороформа, плюс 35 мл метанола и 8 мл воды; 95 мл хлороформа плюс 5 мл метанола; и 90 мл петролейного эфира (60-80 °C) плюс 10 мл диэтилового эфира.
заметка: В двумерном ТСХ используйте n-гексан:ацетон (95:5) в первом направлении три раза и используйте одну разработку с толуолом:ацетоном (97:3) во втором направлении для анализа состава миколиевой кислоты. Чтобы проанализировать PIM, используйте хлороформ:метанол:вода (60:30:6) в первом направлении один раз, и используйте хлороформ:уксусная кислота:метанол:вода (40:25:3:6) во втором направлении. Для анализа PDIM и AG используйте петролейный эфир (60-80 °C): этилацетат (98:2) в первом направлении три раза, и используйте одну разработку с петролейным эфиром (60-80 °C): ацетон (98:2) во втором направлении><.
осторожность: Диэтиловый эфир является потенциально токсичным и опасным веществом. Его необходимо использовать в капюшоне с ламинарным потоком при ношении соответствующих средств индивидуальной защиты (лабораторный халат, защитные очки и нитриловые перчатки).<бр />
осторожность: Дихлорметан является потенциально токсичным и опасным веществом. Его необходимо использовать в капюшоне с ламинарным потоком при ношении соответствующих средств индивидуальной защиты (лабораторный халат, защитные очки и нитриловые перчатки).<бр />
осторожность: Петролейный эфир является потенциально легковоспламеняющимся, вредным для окружающей среды и чрезвычайно опасным веществом. Его необходимо использовать в капюшоне с ламинарным потоком при ношении соответствующих средств индивидуальной защиты (лабораторный халат, защитные очки и нитриловые перчатки).<бр />
осторожность: Уксусная кислота является потенциально легковоспламеняющимся и коррозионным веществом. Его необходимо использовать в капюшоне с ламинарным потоком при ношении соответствующих средств индивидуальной защиты (лабораторный халат, защитные очки и нитриловые перчатки).<бр />
осторожность: Этилацетат является легковоспламеняющимся и опасным веществом. Его необходимо использовать в капюшоне с ламинарным потоком при ношении соответствующих средств индивидуальной защиты (лабораторный халат, защитные очки и нитриловые перчатки).<бр />
осторожность: Ацетон является легковоспламеняющимся и опасным веществом. Его необходимо использовать в капюшоне с ламинарным потоком в соответствующих средствах индивидуальной защиты (лабораторный халат, защитные очки и нитриловые перчатки).
- Закройте камеру TLC, чтобы пропитать ее не менее чем на 20 минут. Тем временем растворите липиды, присутствующие в стеклянной пробирке, в 0,2-1 мл хлороформа.
заметка: Объем, используемый для растворения липидов, может быть изменен в зависимости от желаемой или ожидаемой концентрации образца.
- Нанесите по 10 мкл каждой суспензии с помощью капиллярной стеклянной трубки непосредственно на пластину TLC и дайте образцу высохнуть в течение 5 минут при комнатной температуре.
заметка: Образцы необходимо наносить на нижнюю часть пластины, оставляя по 1 см с каждой стороны. Образцы должны быть отделены друг от друга не менее чем на 0,5 см. После того, как образец нанесен на пластину, пробирки можно снова испарить газообразным азотом и хранить при температуре 4 °C для дальнейшего использования.
- Вставьте пластину в насыщенную камеру TLC, содержащую подвижную фазу. Позвольте мобильной фазе проходить через TLC.
заметка: Любое движение, приложенное к камере TLC, влияет на текущий растворитель на пластине и влияет на подвижность липидов. В случае проведения двухмерного ТСХ, две камеры ТСХ должны содержать обе системы элюирования.
- Снимите пластину с камеры TLC, когда растворитель достигнет расстояния 1 см от верхнего конца пластины. Оставьте пластину под ламинарным флюсом до полного высыхания диоксида кремния.
заметка: В случае анализа состава миколиевой кислоты с использованием n-гексана и диэтилового эфира (85:15) повторите шаги 4.4 и 4.5 еще два раза, пока не будет выполнена подвижная фаза три раза на пластине TLC.
- Обнажите пластину с нужным пятном, при необходимости нагрейте пластину.
заметка: В настоящем эксперименте для распыления пластин TLC использовали 15-20 мл следующих растворов: 10% гидрат молибдатофосфорной кислоты в этаноле до тех пор, пока пластина не станет ярко-желтой, с последующим нагреванием пластины до 120 °C; 5% в этаноле, 20% α-нафтол в серной кислоте с последующим нагреванием плиты до 120 °С; Реагент молибденовый синий (1,3% оксида молибдена в 4,2 М серной кислоте) до появления фосфатных полос или 1% антрона в серной кислоте><.
осторожность: Гидрат молибдатофосфорной кислоты является легковоспламеняющимся и коррозионным веществом. Его необходимо использовать в капюшоне с ламинарным потоком при ношении соответствующих средств индивидуальной защиты (лабораторный халат, защитные очки и нитриловые перчатки).<бр />
осторожность: Этанол является потенциально легковоспламеняющимся и опасным веществом. Его необходимо использовать в капюшоне с ламинарным потоком при ношении соответствующих средств индивидуальной защиты (лабораторный халат, защитные очки и нитриловые перчатки).<бр />
ВНИМАНИЕ: 1-нафтол является легковоспламеняющимся, коррозионным и чрезвычайно опасным веществом. Его необходимо использовать в капюшоне с ламинарным потоком при ношении соответствующих средств индивидуальной защиты (лабораторный халат, защитные очки и нитриловые перчатки).<бр />
осторожность: Реагент Molybdenum Blue Spray является коррозионным, токсичным и чрезвычайно опасным веществом. Его необходимо использовать в капюшоне с ламинарным потоком в соответствующих средствах индивидуальной защиты (лабораторный халат, защитные очки и нитриловые перчатки).
