Очистка бакуловируса на основе гепариновой аффинной хроматографии: метод выделения бакуловируса из надосадочной жидкости клеток насекомых

Аннотация

Источник: Nasimuzzaman, M. et al., Производство и очистка бакуловируса для применения в генной терапии. J. Vis. Exp. (2018)

В этом видео мы демонстрируем метод выделения бакуловируса из надосадочной жидкости клеток насекомых с помощью гепариновой аффинной хроматографии. Выделение облегчается сродством между гепарином в колонке и гликопротеином оболочки бакуловируса.

Протокол

1. Подготовка хроматографической системы

1. Подготовьте хроматографическую систему путем последовательной промывки образцовой и буферной линий стерильной водой, 1 Н гидроксида натрия, водой и промывочным буфером (20 мМ натрий-фосфатного буфера, содержащего 150 мМ хлорида натрия, pH 7,0) с линейной скоростью потока 50 мл/мин.
2. Приготовьте колонку с гепарином 50 мкм (10 × 10 см, 7,9 мл объема колонки (CV)) путем последовательного запуска буфера для очистки колонки (5 CV стерильный 20 мМ натрий-фосфатный буфер, содержащий 2 М натрия хлорида, pH 7,0) и 5 CV промывочного буфера с линейной скоростью потока 7 мл/мин.

2. Очистка вектора бакуловируса

1. Настройте систему хроматографии следующим образом:
   1. Используйте входной порт загрузки проб для загрузки надосадочной жидкости бакуловируса.
   2. Используйте входное отверстие буфера A1 для загрузки буфера промывки. Подготовьте бутылку с буфером для промывки объемом не менее 500 мл и поместите буферную линию промывки в бутылку.
   3. Используйте входной порт буфера A2 для загрузки элюирующего буфера (20 мМ фосфата натрия с 1,5 М хлорида натрия, pH 8,0). Приготовьте флакон с не менее чем 500 мл элюирующего буфера и поместите в него лирующую буферную линию.
   4. Вставьте несколько конических пробирок объемом 50 мл в коллектор фракций, чтобы собрать промежуточную жидкость для колонки, промывочный буфер и элюированный бакуловирус.
2. Уравновесьте гепариновую колонку пятью объемами колонки (CV) промывочного буфера (40 мл) объемом 7,9 мл (40 мл) при линейной скорости потока 7,0 мл/мин.
3. Загрузите 250 мл надосадочной жидкости бакуловируса в гепариновую колонку с помощью насоса для отбора проб (входной порт для проб) хроматографической системы с линейной скоростью потока 2,0 мл/мин.
4. Пропустите 10 CV (80 мл) промывочного буфера через гепариновую колонку с линейным расходом 2,0 мл/мин до тех пор, пока кривая поглощения ультрафиолета (280 нм) не вернется к исходному уровню и не станет стабильной.
5. Элюируйте частицы бакуловируса из гепариновой колонки объемом 7,9 мл с 5 CV (40 мл) элюирующего буфера с линейной скоростью потока 4,0 мл/мин. Следите за резким пиком элюирования белка на хроматограмме, когда частицы бакуловируса диссоциируют с гепариновой колонкой.
6. После элюирования немедленно разведите элюированный надосадочную жидкость бакуловируса в 10 раз, используя 20 мМ буфера фосфата натрия в воде, чтобы предотвратить инактивацию частиц бакуловируса от осмотического шока при последующем центрифугировании.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Акта Авант 150	GE Healthcare	28976337	Хроматографическая система
POROS Heparin 50 μм Колонка	ThermoFisher Scientific	4333414	Гепариновая колонка
Буфер для промывки	Внутри компании	Товар, не относящийся к каталогу	20 ммоль/л фосфатный буфер, содержащий 150 ммоль/л хлорида натрия
Элюирующий буфер	Внутри компании	Товар, не относящийся к каталогу	20 ммоль/л фосфатный буфер, содержащий 1,5 моль/л натрия хлорида
50 мл Коническая трубка	ThermoFisher Scientific	14-959-49А	Для сбора надосадочной жидкости Baculovirus supernatant
Буфер для очистки колонн	Внутри компании	Товар, не относящийся к каталогу	20 ммоль/л фосфатный буфер, содержащий 2,0 моль/л хлорида натрия
Стерильная вода	Внутри компании	Товар, не относящийся к каталогу	Для чистки Akta Avant
Гидроксид натрия	Сигма-Олдрич	1.09137	Для чистки Akta Avant