Катионообменная хроматография: метод выделения целевого рекомбинантного белка из лизата клеток насекомых на основе чистого поверхностного заряда

Аннотация

Источник: Agamasu, C. et al. Полностью обработанный рекомбинантный KRAS4b: выделение и характеристика фарнезилированного и метилированного белка. J. Vis. Exp. (2020)

Это видео демонстрирует технику катионообменной хроматографии для выделения рекомбинантного белка из лизата белка клетки насекомого.

Протокол

1. Очистка белка

1. Подготовьте буферы A–H, как показано в таблице 1.

См. См. См. См.

Буферный раствор	Буферизатор (все 20 мМ)	pH	NaCl (мМ)	Имидазол (мМ)	MgCl2	ТВЭП
a	ХЕПЕС	7.3	300	- T	5	1
В	ХЕПЕС	7.3	300	35	5	1
С	ХЕПЕС	7.3	300	500	5	1
Г	Мчс	6,0	200	- T	5	1
Е	Мчс	6,0	- T	- T	5	1
Ф	Мчс	6,0	100	- T	5	1
Г	Мчс	6,0	1000	- T	5	1
Ч	ХЕПЕС	7.3	300	- T	1	1

2. Подготовьте материалы для очистки (см. Таблицу материалов): коктейль ингибиторов протеазы без ЭДТА или других хелаторов; колонку для иммобилизованной аффинной хроматографии металлов (IMAC); колонку для катионобменной хроматографии (CEX); шприцевой фильтр 0,45 мкм; имидазол 2 М (pH = 7,5); ультрацентрифугу с массой 100 000 x g; высокоскоростную настольную центрифугу с массой 4 000 x g; центробежные фильтрующие агрегаты (10 кДа, НМВЛ); спектрофотометр с возможностью считывания с длиной волны 280 нм; протеаза вируса травления табака (TEV) His6-табака; и хроматографическая аппаратура, способная смешивать два буферных раствора, наносить растворы на колонки, создавать градиентные элюции из колонки и собирать дроби из колонок.
3. Удалите лизат клеток насекомых из диализа и центрифугируйте при давлении 4000 x g в течение 10 минут, чтобы удалить осадок. Окончательный диализованный, осветленный образец на этом этапе все еще часто остается мутным, но может быть нанесен без дальнейшей обработки на последующую колонку CEX.
4. Приготовьте катионообменную колонку объемом 20 мл (см. Таблицу материалов), промыв тремя CV буфера G, затем тремя CV буфера F.
   заметка: Хотя мы не проводили тщательной оценки других смол, несколько коллег обнаружили плохую разрешающую способность смол, отличных от SP Sepharose High Performance Resin.
5. Разбавьте 20 мл диализованного образца до конечной концентрации NaCl 100 мМ путем добавления 20 мл буфера Е и поместите разбавленный образец в колонку катионобмена.
6. Продолжайте нагружать колонку, добавляя в загрузочную пробирку свежеразведенные образцы, приготовленные, как описано выше, по мере того, как предыдущее разбавление приближается к концу загрузки.
   заметка: Разбавление всего образца сразу до 100 мМ NaCl привело к значительным потерям целевого белка из-за осаждения.
7. Промойте колонку до базовой линии Abs280 с помощью буфера F. Обычно для этого требуется 3 CV. Белок элюируется из колонки в течение градиента 400 мл (20 CV) от буфера F до 65% буфера G, собранный во фракции по 6 мл (рис. 1B).
8. Продолжайте промывку колонки для получения дополнительных 1,5 CV (65% буфера G) после завершения градиента.

Результаты

Рисунок 1: Гели SDS-PAGE процесса очистки. (A) Захват IMAC из лизата. FNTA/B - это темные полосы, мигрирующие со скоростью ~48 кДа, а His6-MBP-tev-KRAS4b - это темная полоса, мигрирующая со скоростью ~67 кДа. M = лестница молекулярной массы белка; T = общий белок; L = осветленный лизат/нагрузка в колонку; F = протекание через колонну. Фракции элюируются с возрастающим градиентом концентрации имидазола....

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Пробирки с безопасным замком 1,8 мл, натуральные	Эппендорф	22363204
11 мм Cl SS Сблокированный вкладыш для автосэмплера	Термо Сайентиал	30211СС-1232
5427R Центрифуга	Эппендор
Ацетонитрил, класс ВЭЖХ	Фишер Кемикал	А998-1 1л
Колонка катионобменной хроматографии (CEX)	GE Здравоохранение Медико-биологические науки	29018183	HiPrep SP Sepharose Высокая производительность
Масс-спектрометр Exactive Plus EMR	Термо Сайентиал
Флаконы Жильсона 7х14 мм Тубы	GE Healthcare	БР-1002-12
Высокоскоростная/настольная центрифуга	Thermo Fischer Scientific	05-112-114Д	Способен до 4 000 xg
Протеаза вируса травления табака (TEV) His6-Tobacco Vir	Адджен	92414	Очищено в соответствии с Raran-Kurussi et al. (2017) Удаление аффинити-меток с помощью TEV Protease. В: Берджесс Браун Н. (ред.) Гетерологичная экспрессия генов в E.coli. Методы молекулярной биологии, том 1586. Humana Press, Нью-Йорк, Нью-Йорк
Коктейль ингибиторов протеазы без ЭДТА и других хелаторов	Миллипора Сигма	П8849
Ацетат аммония	Сигма-Олдрич	09689-250г
Газ аргон	Воздушный газ	АРУП
муравьиная кислота	Сигма-Олдрич	Ф0507-500МИ	Используйте класс реагента или лучше
Система хроматографии NGC	БиоРад	78880002	Хроматографическая система NGC QuestTM 100
Комплект липидных экструдеров с держателем	AVANTI ПОЛЯРНЫЕ ЛИПИДЫ	610023
Жидкий азот	Воздушный газ	НИ-ДЬЮАР
Центробежные фильтрующие агрегаты Ultra-15, 10K NMWL	Миллипора Сигма	UFC901008	Мембрана PES
Центрифужные фильтры Ultracel 10K MWCO Ultra 0,5 мл	Амикон	UFC501024
ультрацентрифуга	Бекман Коултер	Оптима - L80K	Способен на 100 000 XG
Ребята	сигма	С3023