$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Подготовка буферов
- Чтобы приготовить промывочный буфер ELISA, добавьте 3,94 г трис-основания, 8,77 г NaCl и 1 г бычьего сывороточного альбумина (BSA) в 1 л деионизированной (DI) воды. Добавьте 500 мкл полисорбата-20. Отрегулируйте pH до 7,2 с помощью HCl или NaOH.
- Чтобы подготовить блокирующий буфер, добавьте 3,94 г Tris-base, 8,77 г NaCl и 10 г BSA. Добавьте 500 мкл полисорбата-20 в 1 л деионизированной воды. Отрегулируйте pH до 7,2 с помощью HCl или NaOH.
- Для приготовления элюирующего буфера (PBS) добавьте 8,01 г NaCl, 2,7 г KCl, 1,42 г Na2HPO4 и 0,24 г KH2PO4 в 1 л воды DI. Отрегулируйте pH до 7,4 с помощью HCl или NaOH.
заметка: Можно приготовить 10-кратный раствор этого буфера и разбавить его деионизионной водой по мере необходимости.
2. Подготовка образца OMV
- Выращивание клеток A. actinomycetemcomitans до поздней экспоненциальной фазы (оптическая плотность при 600 нм 0,7). Гранулируйте ячейки путем двойного центрифугирования при 10 000 x g при 4 °C в течение 10 минут. Отфильтруйте надосадочную жидкость через фильтр 0,45 мкм.
- Концентрируйте небактериальную надосадочную жидкость с помощью фильтров с молекулярной массой 50 кДа. Ультрацентрифугирование концентрированного раствора при 105 000 x g при 4 °C в течение 30 мин.
- Повторно суспендируйте гранулу в PBS и ультрацентрифуге (105 000 x g при 4 °C в течение 30 мин.) Повторно суспендируйте гранулу в 2 мл PBS.
3. Упаковка колонны S-1000
- Смешайте бутылочку со стоком геля фильтрующего средства со стеклянной мешалкой и вылейте в стеклянную бутылку объем, необходимый для заполнения колонки, плюс примерно 50% излишка (около 135 мл). Дайте этим бусинам постоять, пока они не осядут, а затем сцедите лишнюю жидкость. Ресуспендируйте гранулы в элюирующем буфере, так что конечный раствор составляет примерно 70% (по объему) геля, 30% буфера. Дегазируйте раствор под вакуумом.
- Установите стеклянную колонну вертикально с помощью кольцевой подставки и заполните элюирующим буфером, чтобы смочить стенки колонны. Слейте воду из буфера до тех пор, пока в колонне не останется всего около 1 см буфера.
- Не создавая пузырей, аккуратно пипетками впрыскиваем шарики в колонку, заполняя колонку доверху. Продолжайте сливать лишний буфер на протяжении всего процесса. Убедитесь, что вы не даете бусинам полностью осесть, прежде чем добавлять дополнительные бусины в верхнюю часть столбика. Колонна должна быть утрамбована на высоте примерно на 2 см ниже дна резервуара колонны.
4. Загрузка образца и сбор дробей
- Дегазируйте элюирующий буфер под вакуумом. Промойте колонку двумя колонками-объемами (180 мл) элюирующего буфера.
- Дайте оставшемуся буферу полностью войти в столбец. После того, как буфер достигнет верхней части гелевого слоя, осторожно нанесите пипеткой образец объемом 2 мл, содержащий OMV (с концентрацией липидов примерно 100 - 200 нмоль/л) на поверхность гранул, стараясь не повредить ни одну из бусин в верхней части колонки. Дайте образцу полностью войти в гель, то есть когда над слоем геля не останется жидкости.
- Осторожно и медленно добавьте элюирующий буфер поверх гелевой колонки. Не тревожьте верхний слой геля, так как это вызовет разведение пробы.
- Поместите одну трубку объемом 50 мл под колонку и откройте колонку. Соберите первые 20 мл элюента. Добавьте дополнительный буфер для элюирования в верхнюю часть колонны, осторожно, по мере необходимости, чтобы колонка никогда не была сухой.
- Поместите под колонну серию пробирок объемом 1,5 мл. Запустите колонку и соберите серию образцов объемом 1 мл в каждой пробирке. По мере сбора образцов продолжайте добавлять буфер элюирования в верхнюю часть столбца, если это необходимо. Повторяйте до тех пор, пока не будет собрано 96 фракций. Остановите столбец.
заметка: Образцы должны храниться при температуре -20 °C при длительном хранении или при 4 °C при краткосрочном хранении до дальнейшего анализа.
- Чтобы очистить колонку, пропустите через колонку один объем (90 мл) 0,1 М NaOH. Пропустите через колонку два объема (180 мл) элюирующего буфера.