Бутил-зависимая гидрофобная жидкостная хроматография: метод характеристики конъюгатов антитело-лекарство на основе гидрофобных взаимодействий

Аннотация

Источник: Oller-Salvia, B. Генетическое кодирование неканонической аминокислоты для генерации конъюгатов антитело-лекарство посредством быстрой биоортогональной реакции. J. Vis. Exp. (2018).

Это видео демонстрирует характеристику конъюгатов антитело-лекарство на основе гидрофобного взаимодействия жидкостной хроматографии. С помощью хроматографической колонки на основе бутиллиганда конъюгаты антитело-лекарство характеризуются посредством гидрофобных взаимодействий с лигандом.

Протокол

1. Производство и характеристика антитела

1. Экспрессия антител
   1. Разморозьте флакон с суспензионными клетками HEK в колбе объемом 250 мл, содержащей 50 мл сцеживающей среды с добавлением 100 ЕД/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина и 250 нг/мл амфотерицина B. Поддерживайте клетки при температуре 37 °C с 8%_CO2 в увлажненных инкубаторах, оборудованных шейкером, при 125 об/мин. Расщепляйте клетки до 0,3-0,5 х 10⁶ клеток/мл (каждые 2-3 дня) не менее 2 раз перед трансфекцией.
   2. При достижении плотности 2,5 х 10⁶ клеток/мл (через 2-3 дня после расщепления) приготовьте свежий раствор в концентрации 100 мМ CypK.....

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Экспи293Ф	ThermoFisher Scientific	А14527	Суспензионные элементы HEK
Среда для сцеживания Expi293	ThermoFisher Scientific	A1435101	Средство выражения
Антибиотик-антимикотик	ThermoFisher Scientific	15240062	Пенициллин-стрептомицин-амфотерицин В
Колба Эрленмейера из поликарбоната 125 мл с вентиляционной крышкой	Корнинг	431143	Встряхивайте колбы
Инкубатор Brunswick S41i	Эппендорф	S41I230011	CO2-инкубатор с шейкером
Натрия гидроксид 4 моль/л (4 Н) в водном растворе	ВВР	191373М
Циклопропен лизин	Сихем	СК-8017	В данном исследовании он был синтезирован в соответствии с описанием Elliot et al. 2014
Стерифлип-ГП, 0,22 мкм, полиэфирсульфон, гамма-облученный	Мерк Миллипор	SCGP00525
Opti-MEM, Средство для пониженного содержания сыворотки	ThermoFisher Scientific	31985070	Пониженное содержание сывороточной среды
Набор для трансфекции ExpiFectamine 293	ThermoFisher Scientific	А14525	Реагент для трансфекции
Центрифуга 5810 R	Эппендорф	5811000460
Millex-GP Шприцевой фильтрующий блок, 0,22 мкм, полиэфирсульфон, 33 мм, гамма-стерилизованный	Мерк Миллипор	SLGP033RS
Смола протеина А	Сино Биакал	10600-П07Э-РН-25
Колонки для хроматографии Poly-Prep, шт. 50	Био-Рад	7311550	Полипропиленовая хроматографическая колонка
Эконом-колонная воронка	Био-Рад	7310003
Цитрат натрия	Флюка	71635
ÄKTA explorer FPLC	GE Healthcare
Набор для выбора HiTrap HIC	GE Healthcare	Тел.: 28-4110-07	В комплекте HiTrap 1 мл бутила HP
Сульфат аммония	ВВР	No 2133.296
Изопропанол	Хонивелл	34863-2,5 л
Диметилсульфоксид	Сигма-Олдрич	Д8418-50МЛ
Тетразин-vcMMAE	ХимПартнер	- T	Костум синтезированный
Тетразин-5-ТАМРА	Йена Бионаука	КЛК-017-05
NuPAGE 4-12% Bis-Tris Гель 1,0 мм x 10 лунок	ThermoFisherНаучные	NP0321BOX
Xcell SureLock Mini-Cell	ThermoFisherНаучные	ЭИ0001
UltiMate 3000 ВЭЖХ	ThermoFisherНаучные
Thermo Scientific MAbPac, HIC-20, 4,6 x 100 мм, 5 μм	ThermoFisherНаучные	No 88553
Технология NanoAcquity	воды
Сыворотка крови человека	Сигма-Олдрич	Х4522-20мл
CO2-инкубатор	Панасоник
Монометилауристатин Е	Кайман Кемикал	No 16267
НаноДроп 2000	ThermoFisherНаучные		Микрообъемный спектрофотометр
ИнтантБлю	Expedeon	ISB1L	Морилка на основе кумасси
Туба 50 мл, 114x28 мм, PP	Сарштедт	No 62.547.254 (Английский)	Коническая труба
Центробежные фильтрующие агрегаты Amicon Ultra-15 50 000 НМВЛ	Мерк	UFC905024	Концентратор центробежной фильтрации (после извлечения белка А)
Центробежные фильтрующие агрегаты Amicon Ultra-4 50 000 NMWL	Мерк	UFC805024	Центробежные фильтрационные концентраторы (после очистки FPLC или ВЭЖХ)
Обессоливающие колонны Zeba, 7K MWCO, 0,5 мл	ThermoFisherНаучные	89882	Исключение размера спин-колонн
Пробирка ПЦР 0,2 мл плоская крышка	Чертополох Сайентиал Лтд	-ПЦР-02-С-КС	ПЦР-пробирки

Стандарты