1. Производство и характеристика антитела
- Экспрессия антител
- Разморозьте флакон с суспензионными клетками HEK в колбе объемом 250 мл, содержащей 50 мл сцеживающей среды с добавлением 100 ЕД/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина и 250 нг/мл амфотерицина B. Поддерживайте клетки при температуре 37 °C с 8%CO2 в увлажненных инкубаторах, оборудованных шейкером, при 125 об/мин. Расщепляйте клетки до 0,3-0,5 х 106 клеток/мл (каждые 2-3 дня) не менее 2 раз перед трансфекцией.
- При достижении плотности 2,5 х 106 клеток/мл (через 2-3 дня после расщепления) приготовьте свежий раствор в концентрации 100 мМ CypK. Для этого нужно взвесить 64 мг CypK, добавить 2,5 мл 0,1 гидроксида натрия, совершить вортекс, открутить вниз для восстановления всех нерастворенных частиц и ультразвуком.
- Добавьте 2,5 мл CypK (100 мМ в 0,1 М NaOH) к 42,5 мл среды для сцеживания с добавлением антибиотиков. Хорошо перемешайте, добавьте 250 μL 0,1 M HCl и простерилизуйте с помощью фильтра 0,22 μm.
- Развести 50 мкг плазмид HC и LC pKym1 до 2,5 мл с восстановленной сывороточной средой. В отдельной пробирке разведите 135 мкл реагента для трансфекции до 2,5 мл с восстановленной сывороточной средой.
- Через пять минут после приготовления растворов смешать плазмиды и раствор реагента для трансфекции и инкубировать в течение 20 минут, чтобы обеспечить образование комплексов между ДНК и реагентом для трансфекции.
- Тем временем центрифугируют 125 миллионов клеток при целевой плотности в течение 5 мин при 500 x g, ресуспендируют с помощью экспрессирующей среды, содержащей CypK, и добавляют смесь реагентов ДНК и трансфекции. CypK можно приобрести или синтезировать, как сообщалось ранее.
- После инкубации клеток в течение 20 ч добавьте 250 мкл усилителей реагентов для трансфекции, входящих в комплект.
- Соберите антитела из надосадочной жидкости через 6-7 дней после добавления CypK (смена среды во время экспрессии не требуется).
* В качестве альтернативы, для получения более высоких и стабильных выходов можно получить стабильную клеточную линию, как описано в Oller-Salvia et al. 2018. В этом случае трастузумаб(CypK)2 экспрессируется простым добавлением CypK 5 мМ в среду экспрессии.
- Очистите антитела
- Центрифугируйте ячейки в течение 15 мин при 3000 x g.
- Отфильтруйте надосадочную жидкость с помощью фильтра 0,45 или 0,22 мкм. Если фильтр закупорился, замените его на новый и продолжайте фильтрацию. Если это происходит уже через несколько миллилитров, центрифугируйте надосадочную жидкость в течение дополнительных 15 минут при 7000 x g.
- Добавьте смолу протеина А (2 мл/100 мл надосадочной жидкости) в пустую полипропиленовую хроматографическую колонку и уравновесьте смолу не менее чем 5 объемами буфера для промывки гранул (0,1 М фосфата натрия, 150 мМ NaCl).
- Разделите надосадочную жидкость на две конические пробирки по 50 мл и добавьте 5-кратный буфер для промывки шариков (0,5 М фосфата натрия, 150 мМ NaCl), а затем предварительно уравновешенную смолу протеина А. Поместите коническую трубку на валик на 3 ч при комнатной температуре, чтобы вытянуть антитела из надосадочной жидкости.
- В качестве альтернативы: Добавьте надосадочную жидкость на колонку с не менее чем вдвое большим рекомендуемым объемом смолы и дайте ей пройти. Убедитесь, что в надосадочной жидкости не осталось значительного количества антител с помощью SDS-PAGE. Если есть, снова протрите надосадочную жидкость через смолу.
- Перенесите смолу белка А с надосадочной жидкостью в столбик и дайте жидкости пройти.
- Добавьте 25 мл промывочного буфера (или не менее 10 объемов смолы) и дайте стечь.
- Разбавьте антитело 4 мл 0,1 М цитрата натрия, pH 3, на 1 мл 1 М фосфатного буфера, 150 мМ NaCl.
- Разбавьте антитело 10 мл PBS, сконцентрируйте до 0,5-1 мл методом центробежной фильтрации и трижды обменяйте буфер с PBS.
- Очистите образцы методом FPLC с использованием бутиловой колонки HIC с расходом 0,5 мл/мин и градиентом 0-100% в течение 30 мин буфера с низким содержанием солей (50 мМ фосфата натрия pH 7,0, 20% изопропанола) в буфере с высоким содержанием солей (1,5 М (NH4)2SO4, 50 мМ фосфата натрия pH 7,0, 5% изопропанола). Соберите все фракции и следите за элюированием на длине волны 280 нм. Небольшие количества (< 1 мг) могут быть очищены с помощью ВЭЖХ-HIC в условиях, описанных в 2.4, для максимального выхода и чистоты.
- Объедините фракции, содержащие антитела, разбавьте их не менее чем до 4 мл с PBS, сконцентрируйте их методом центробежной фильтрации и трижды обменяйте буфер с PBS.
- Количественная оценка антител
- Получить примерную концентрацию можно путем измерения поглощения на длине волны 280 нм с помощью микрообъемного спектрофотометра.
- Если требуется точное измерение, используйте набор ИФА для измерения IgG человека. Для приблизительной оценки используйте SDS-PAGE с морилкой на основе Кумасси следующим образом:
- Приготовьте стандарты, разбавив в шесть раз в два раза стандарт трастузумаба, определенный методом ИФА, в концентрации 1 мг/мл.
- Вскипятите стандарты и образцы при концентрации около 0,25 мг/мл в буфере для редуцирования.
- Запустите их в 4-12% Bis-Tris SDS-PAGE с использованием буфера MES-SDS и окрасьте красителем на основе кумасси. Наконец, измерьте плотность цвета полосы, соответствующей световой или тяжелой цепи, с помощью ImageJ и интерполируйте сигнал из образцов в стандартную кривую.
- Храните антитело при температуре 4 °C.
2. Конъюгирование антитела и характеристика АЦП
- Конъюгируйте антитело с молекулой, содержащей тетразин
- Разбавьте 10 молярных эквивалентов тетразина-vcMMAE (4 мкл, 3,4 мМ в диметилсульфоксиде (ДМСО)) с 20 мкл ацетонитрила и 76 мкл PBS в небольшой конической пробирке (например, ПЦР-пробирке).
- Добавьте 1 молярный эквивалент трастузумаба (CypK)2 (100 μл, 2 мг/мл в PBS), тщательно перемешайте и дайте вступить в реакцию в течение 3 часов при комнатной температуре (25 °C) с образованием трастузумаба (MMAE)2,
заметка: Другие молекулы, такие как тетразин-5-TAMRA, могут быть связаны с антителом вместо тетразина-vcMMAE с использованием этого протокола.
- Очистка АЦП
- Предварительно уравновесьте вращающуюся колонну исключения размера с помощью PBS в соответствии с инструкциями производителя.
- Добавьте весь объем реакции на спиновой колонне и центрифугируйте при 1500 х г в течение 1 мин.
- Количественное определение АЦП и анализ сопряженного вещества с помощью SDS-PAGE
- Количественно определите АЦП, как описано в. 1.3.2, путем измерения плотности цвета легкой цепи на SDS-PAGE с использованием немодифицированного антитела для стандартной кривой.
- Тяжелая цепь должна была немного сдвинуться, что свидетельствует об увеличении молекулярной массы при конъюгации.
Примечание: Если антитело модифицируют флуорофором, таким как трастузумаб (TAMRA)2, только полоса, соответствующая тяжелой цепи, должна проявлять флуоресценцию в геле перед окрашиванием.
- Анализ конъюгата с помощью ВЭЖХ-HIC
- Уравновесить колонку ВЭЖХ-HIC со 100% буфером А (1,5 М (NH4)2SO4, 50 мМ фосфата натрия pH 7,0, 5% изопропанола) в течение 5 мин.
- Смешайте 15 мкл (67 пмоль) раствора трастузумаба (CypK)2 в дозе 1 мг/мл с 15 мкл 2x буфера А во флаконе. Затем запрограммируйте впрыск 10 мкл в ВЭЖХ.
- Разбавлять изократическим потоком 1 мл/мин со 100% буфером А в течение 1 мин с последующим 15-минутным градиентом от 100 до 0% буфера А в В (50 мМ фосфата натрия pH 7,0, 20% изопропанола). Следите за элюированием на длине волны 280 нм.
- Рассчитайте DAR путем интегрирования пика, соответствующего каждому веществу, и используя полученные площади в следующем уравнении:
DAR = (1x трастузумаб(MMAE) + 2x трастузумаб(MMAE)2)
/(трастузумаб(MMAE)0 + трастузумаб(MMAE)1 + трастузумаб(MMAE)2)
Ожидаемое время удержания трастузумаба (CypK)2 составляет 7,5-8,0 мин, трастузумаба (CypK, MMAE) – 9,1-9,6 мин, а трастузумаба (MMAE)2 – 10,5-11,0 мин.