Флуоресцентная эксклюзионная хроматография с детекцией размера: метод определения целостности флуоресцентных мембранных белков при солюбилизации детергентом

Аннотация

Источник: Bird, L. E., et al. зеленый флуоресцентный скрининг экспрессии мембранных белков в Escherichia coli. J. Vis. Exp. (2015)

В этом видео мы демонстрируем метод флуоресцентной хроматографии с эксклюзионным исключением размера для скрининга стабильности зеленого флуоресцентного белка (GFP)-слитого мембранного белка в Escherichia coli после солюбилизации с помощью детергента. Белки, демонстрирующие симметричный пик в профиле исключения размера с небольшим количеством свободного GFP или без него, указывают на очищенные белки с минимальной деградацией и агрегацией, которые впоследствии могут быть отобраны для структурно-функционального анализа.

Протокол

1.Солюбилизация и анализ мембранной фракции

1. Разморозьте мембранную фракцию (при необходимости), и для каждого моющего средства, используемого для солюбилизации, внесите 900 мкл мембранной суспензии в полиалломерную микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл.
2. Добавьте по 100 мкл каждого свежеприготовленного моющего средства (10% масс растворов ДДМ, ДМ, Цимал-6 и LDAO) до конечной концентрации 1% в указанную пробирку объемом 1,5 мл. Для солюбилизации белков эукариотической мембраны в состав моющих средств можно добавлять холестерин гемисукцинат (конечная концентрация 0,2%).
3. Инкубируйте смеси при температуре 4 °C в течение 1 часа при слабом перемешивании.
4. Гранулируйте нерастворимую фракцию моющего средства с помощью настольной ультрацентрифуги, следя за тем, чтобы пробирки были заполнены не менее чем наполовину, при 150 000 г при 4 °C в течение 45 минут и удерживайте надосадочную жидкость><. заметка: Эффективность солюбилизации детергентом можно оценить с помощью считывателя флуоресцентных пластин путем измерения флуоресценции GFP солюбилизированных мембран с нерастворимой фракцией детергента, ресуспендированной в том же объеме PBS.
5. Анализ монодисперсности различных комплексов детергентных и мембранных белков с помощью флуоресцентно-определяемой эксклюзионной хроматографии (FSEC).
6. Для анализа FSEC уравновесьте колонку исключения размера с широким диапазоном фракционирования, например, от 5 000 до 5 000 000 молекулярной массы, с рабочим буфером (20 мМ Tris pH 7,5, 150 мМ NaCl, 0,03% DDM) со скоростью потока 0,3 мл/мин. Используйте этот буфер для всех образцов, т. е. он не изменяется для каждого тестируемого моющего средства.
7. Введите в колонку 100 мкл растворенных мембран со скоростью потока 0,3 мл/мин. Контролируйте профиль элюирования с помощью флуоресцентной оптики (возбуждение на длине волны 488 нм и излучение на длине волны 512 нм). Если встроенный флуоресцентный монитор недоступен, соберите дроби и считайте флуоресценцию в считывателе пластин.
8. Импортируйте данные об объеме элюирования и интенсивности флуоресценции в программу для работы с электронными таблицами для графического отображения.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Холестерин гемисукцинат	Сигма-Олдрич	С6512
CYMAL-6 (6-циклогексил-1-гексил-βD-мальтозид)	Анатрасс	С326
ДДМ (н-додецил β-мальтозид)	Дженерон	Д97002
ДМ (н-децил β-мальтозид)	Дженерон	Д99003
LDAO (N,N-диметил-ндодециламин N-оксид)	Дженерон	Д71111
Стандарт флуоресцентного белка BenchMark	Технологии Life	ЛК5928
Ультрацентрифуга Optima L-100 с ротором 45-Ti	Бекман Коултер	393253
Ультрацентрифуга Optima Max-XP с ротором TLA-55	Бекман Коултер	393315
Prominence UFLC с флуоресцентным детектором RF-20A	Симадзу
Сефароза 6 10/300 GL размер эксклюзионная колонка	GE Healthcare	Тел.: 17-5172-01