Аффинная хроматография на основе DFE: метод очистки моноклональных антител 2F5 из сырого образца с использованием условий элюирования на основе высокой ионной силы

Abstract

Источник: Knödler, M. et al., Активированная сшитая агароза для быстрой разработки аффинных хроматографических смол - захват антител как тематическое исследование. J. Vis. Exp. (2019).

Это видео описывает технику аффинной хроматографии для очистки моноклональных антител 2F5 с использованием лигандов DsRed-2F5-Epitope или DFE. Очищенные моноклональные антитела 2F5 являются необходимыми препаратами в иммунотерапии.

Protocol

1. Тестирование очистки mAb из экстрактов осветленных растений

1. Приготовьте 100 мл осветленного растительного экстракта, содержащего 2F55 или надосадочную жидкость из предпочтительной клеточной системы экспрессии, также содержащую 2F5.
2. Приготовьте уравновешивающий буфер (20 мМ фосфата натрия, 500 мМ хлорида натрия, pH 7,4), элюирующий буфер с низким pH (0,05 М цитрат, 0,05 М хлорида натрия, pH 4,0–3,25) и элюирующий буфер с высокой ионной силой (1,0–4,0 М хлорида магния, 0,1 М HEPES, pH 8,0)
3. Промойте хроматографическую систему с буферами. Установите аффинную колонку DFE (см. основной текст протокола) на хроматографическую систему и уравновесьте 5 CV уравновешивающего буфера при скорости потока 1,0 мл ^мин-1. Контролируйте поглощение ультрафиолета на длине волны 280 нм.<бр/> заметка: Загрузка растительного экстракта или надосадочной жидкости клеточной культуры в колонку может вызвать увеличение противодавления. Установите предупреждение о высоком давлении на уровне 0,2 МПа, чтобы избежать повреждения хроматографической системы или колонки DFE.
4. Загрузите 80 мл осветленного растительного экстракта или надосадочной жидкости (шаг 1.1) в колонку со скоростью потока 0,5 мл мин-1, чтобы гарантировать время контакта 2 мин. Соберите проточные образцы в фракции по 2 мл для реконструкции прорывной кривой. Храните проточные образцы при температуре 4 °C, если немедленный анализ образца невозможен.
5. Промойте колонку 6 CV уравновешивающего буфера. Соберите образец промывки в начале, середине и конце этого шага.
6. Elute mAb 2F5 с 5 CV элюирующего буфера с низким pH или элюирующего буфера с высокой ионной силой (0,1 M HEPES, 1,25 M хлорида магния, pH 8,0). Соберите фракцию DFE, когда сигнал UV 280 нм увеличился на 5 мАЕ выше базового уровня.
   1. Оптимизируйте буфер элюирования для каждой пары эпитоп-антитело. Для 2F5 1,25 М хлорида магния достигнут оптимальный баланс между извлечением продукта и стабильностью лиганда><. заметка: Раствор хлорида магния подвержен выпадению осадков. Поэтому растворите хлорид магния в ~700 мл воды. Отдельно растворите HEPES в 100 мл воды и отрегулируйте pH до 8,0. Добавьте растворенный раствор хлорида магния в раствор HEPES и долейте воду до конечного объема 1,0 л. Не регулируйте pH после растворения хлорида магния, так как это приведет к выпадению осадков.
7. Проанализируйте все образцы, взятые на этапах 1.4–1.6 с помощью метода Брэдфорда, электрофореза на основе додецилсульфата лития и полиакриламидного геля (LDSPAGE) и спектроскопии поверхностного плазмонного резонанса (SPR).

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
DsRed	Фраунгофе IME	н/д	Стандарт
HiTrap NHS-активированный сефарозный HP, 1 мл	GE Helthcare	17-0716-01 (Английский	Хроматографические колонки
ХЕПЕС	Карл Рот ГмбХ	9105.3 Телефон 9105.3	Буферный компонент
Хлорид магния	Карл Рот ГмбХ	КК36.2	Буферный компонент
РН 3110	WTW	2АА110	pH-метр
Sephadex G-25 тонкий, сшитый декстран	GE Helthcare	17003301	Хроматографическая смола
Хлорид натрия	Карл Рот ГмбХ	Р029.2	Буферный компонент
Цитрат натрия	Карл Рот ГмбХ	ХН13.2	Буферный компонент