Методическая статья

Анализ активности ферментов на основе тонкослойной хроматографии: метод определения активности пирофосфокиназы in vitro с помощью тонкослойной хроматографии

8 июля 2025 г.

В этой статье

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Источник: Pokhrel, A., et al. Анализ Очистка и активность in vitro для синтетазы (p)ppGpp из Clostridium difficile. J. Vis. Exp. (2018).

Это видео демонстрирует анализ ферментов на основе тонкослойной хроматографии для определения активности пирофосфокиназы с использованием нуклеотидов, меченных радиоактивными метками. Этот метод позволяет получить представление о синтезе нуклеотидов и реакциях фосфотрансфера.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Анализ активности белка с помощью тонкослойной хроматографии

  1. Подготовьте пластину для тонкослойной хроматографии (ТСХ).
    1. Полиэтилениминовые (ПЭИ)-целлюлозные пластины подготавливают путем промывки в деионизированной воде. Поместите тарелки в стеклянную камеру с двойной дистиллированной водой на глубину ~0,5 см.
    2. Дайте воде мигрировать к верхней части тарелки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Мытье пластин не является строго необходимым, так как пластины можно использовать и без него, но мытье действительно повышает четкость получаемых изображений. Промывка пластин в двух перпендикулярных направлениях дополнительно гарантирует, что любые загрязнения, присутствующие в смоле, будут изолированы в одном углу пластины (рис. 1).
    3. Достаньте тарелки из стеклянной камеры и оставьте на настольной полке сушиться на ночь (12–18 часов).
    4. Отметьте мягким карандашом сухие пластины на расстоянии 2,0 см от одного края, чтобы указать, где будут применяться образцы для TLC. Для образцов объемом 2 мкл наносите образцы на расстоянии не менее 1,0 см друг от друга (рис. 1).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Это обеспечивает четкое разделение между соседними пятнами, что имеет решающее значение для количественной оценки сигнала. До тех пор, пока целлюлозная смола не поцарапана, мелкие карандашные следы на поверхности не будут препятствовать миграции растворителя.
    5. Планируя эксперименты, всегда оставляйте одно место на каждой тарелке неиспользованным.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Это обеспечит пустую полосу для количественного определения образца (Рисунок 1). На плите TLC 20 см хватит места для 19 точек.
  2. Анализ активности ферментов
    1. Приготовьте 5x буферную смесь, содержащую 50 мМ Tris-HCl (pH 7,5), 25 мМ ацетата аммония, 10 мМ KCl, 1 mM DTT и 0,6 мМ АТФ (аденозинтрифосфат).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Эту смесь можно готовить в больших количествах и замораживать в аликвотах объемом 10 мкл для последующего использования. Не подвергайте смесь многократным циклам замораживания-размораживания.
    2. Готовят индивидуальные реакции, содержащие 3 мкМ RSH (гомологические ферменты Rel/Spo), 1x буферную смесь, 0,6 мМ GDP (гуанозиндифосфат), 1,2 мМ MgCl2. Добавьте 1,0 μКи γ-32P-АТФ (радиоактивно меченный АТФ) на 10 μл реакции и используйте воду, не содержащую нуклеаз, чтобы довести реакцию до желаемого объема. Добавьте RSH после смешивания других компонентов, так как добавление RSH к нуклеотидсодержащей смеси инициирует анализ ферментативной активности.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Окончательный объем реакции будет зависеть от количества отобранных временных точек. Чтобы взять образец объемом 2 мкл/тайм-пойнт, соберите 10 мкл реакционной смеси для каждых 4 тайм-точек.
    3. Чтобы контролировать гидролиз АТФ от загрязняющей нуклеазной активности, соберите реакцию объемом 10 μл, не содержащую белка, и инкубируйте ее параллельно. Выявляйте образцы объемом 2 мкл при t = 0 и в конце эксперимента, чтобы убедиться, что АТФ не гидролизуется в отсутствие белка.
    4. Сразу после добавления РСГ удалите 2 мкл и нанесите его на маркированную пластину PEI-целлюлозы в виде образца t = 0 мин.
    5. Инкубируйте реакцию при 37 °C, удаляя 2 мкл аликвот в желаемые моменты времени.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Ферментативная активность прекращается, когда образец адсорбируется на целлюлозной пластине. Подождите 10–30 минут после добавления последнего пятна на планшет перед проявлением, чтобы обеспечить полную адсорбцию и сушку образца.
  3. Тонкослойная хроматография
    1. Заполните хроматографическую камеру 1,5 М 1,5 М KH2PO4 (pH 3,64) на глубину 0,5 см.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Необходимый объем будет зависеть от размеров хроматографа. Любой стеклянный контейнер с ровным дном, достаточно широким, чтобы можно было вставить пластину TLC без изгиба, может быть использован в качестве проявляющего бака с добавлением крышки. Пластину TLC можно разрезать на более узкие полоски с помощью чистого бритвенного лезвия, чтобы обеспечить проявку в стеклянном стакане, покрытом пластиковой пленкой.
    2. Погрузите нижний край тарелки в растворитель. Дайте растворителю мигрировать в верхнюю часть пластины (~90 мин).
      ПРИМЕЧАНИЕ: В то время как миграция растворителя будет остановлена в верхней части планшета и образцы не будут потеряны или слиты во время более длительного погружения, планшеты не следует оставлять в растворителе на ночь. Погружения более чем на 4 часа могут привести к отделению смолы от подложки пластины и потере сигнала.
    3. Извлеките пластину из резервуара для хроматографии и поместите ее на настольную сушилку.
    4. Дайте пластине высохнуть на воздухе в течение ночи.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Сушку можно ускорить с помощью фена. Сухость можно оценить по цвету смолы, которая при намокании потемнеет, а при полном высыхании вернется к цвету неиспользованной пластины.
    5. После того как пластина высохнет, оберните ее полиэтиленовой пленкой, чтобы избежать попадания радиоактивного материала на видеокассету, и проанализируйте ее с помощью авторадиографии (рис. 2).
  4. анализ данных
    1. Поместите пластину из полиэтиленовой целлюлозы, содержащую разделенные реакции, в кассету с фосфоримиджером на 4 ч при комнатной температуре.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этого достаточно, чтобы получить очень четкое изображение с использованием указанных концентраций свежего γ-32P-ATP. При использовании меньшего количества радиоактивно меченного субстрата время экспозиции может быть увеличено до 12-16 часов.
    2. Нанесите изображение кассеты на люминовизор.
    3. Используя программное обеспечение для обработки изображений с графическим пользовательским интерфейсом, нарисуйте области интереса (ROI), выбрав «Нарисовать прямоугольник» и используя мышь, нарисуйте прямоугольные ROI вокруг одной целой полосы и точек ATP и ppGpp (тетрафосфат гуанозин), содержащихся в этой полосе (рис. 2).
    4. Используйте команды «Выбрать», «Копировать» и «Вставить» (или соответствующие команды в зависимости от используемого программного обеспечения для обработки изображений) для отображения идентичных ROI в пределах других полос, чтобы гарантировать, что ROI измеряют сигнал в идентичных областях на каждой полосе. Включите ROI по неиспользуемой полосе, которые будут использоваться в качестве пустых вариантов.
    5. Использование функции Analyze | Инструменты | Менеджер по окупаемости инвестиций | Добавьте команды программного обеспечения для обработки изображений, выберите все показатели рентабельности инвестиций, нарисованные на целлюлозной пластине PEI.
    6. Использование функции Analyze | Установить мерки | Команда измерения, количественная оценка интенсивности сигнала в пределах каждого ROI и экспорт измерений в виде таблицы (рис. 2). Вычитаем пустые значения ROI из экспериментальных сигналов.
      figure-protocol-1
    7. Рассчитайте, какой процент заглушенного сигнала на каждой полосе приходится на ATP и ppGpp, используя формулы.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Рентабельность инвестиций может быть рассчитана и количественно определена с помощью коммерческого программного обеспечения, совместимого с фосфоримиджером или свободно доступным программным обеспечением ImageJ (Национальные институты здравоохранения).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

figure-results-1
Рисунок 1: Подготовка пластин TLC. (A) Пластины промываются в одном измерении, помещая нижний край в воду (синий). Загрязнения (желтые) мигрируют в верхнюю часть пластины вместе с растворителем. (В) После того, как тарелка полностью высохла, ее промывают во втором измерении, поворачивая ее на 90° относительно первой промывки и снова позволяя воде мигрировать к верхней части тарелки. (C) После промывки ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
Конфликт интересов не декларируется.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Резервуар для проявки тонкослойного хроматографа (ТСХ)Генеральная стеклодувная компания80-3
Пластины из полиэтиленимин-целлюлозы (20 см x 20 см, толщина 100 мкм) с полиэфирной основойСигма-ОлдричZ122882-25 шт.
АТФ, [γ-32P]- 3000 Ки/ммоль, 10 мКи/мл свинец, 100 μКиПеркин ЭлмерNEG002A
Аденозин 5'-трифосфат (АТФ) 100 мМБио Бейсик КанадаАВ0311
Гуанозин-5'-дифосфатдинатриевая соль (GDP)Альфа АэсарAAJ61646MC/E
Накопительный люминофорный экранGE Здравоохранение Медико-биологические наукиBAS-IP TR 2040 E Тритиевый экран
Люминовизор Storm 860GE Здравоохранение Медико-биологические науки- T

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Radiolabeled ATPGuanosine TetraphosphatePEI Cellulose PlateAutoradiography AnalysisPhosphorimager ImagingReaction Mixture PreparationTime Point Sampling

Похожие статьи