1. Высокоэффективная тонкослойная хроматография (HPTLC) для полуколичественного определения количества нескольких липидов, включая холестерин, фосфолипиды и сфингомиелин
- Приготовьте следующие четыре раствора для бега и окрашивания.
- Решение 1: Смешайте этилацетат (26,6%), 1-пропанол (26,6%), хлороформ (26,6%), метанол (26,6%) и хлорид калия (9,6%). Приготовьте KCl, растворив 0,25 г KCl в 100 мл воды качества ВЭЖХ.
- Решение 2: Смешайте н-гексан (73%), диэтиловый эфир (23%) и лимонную кислоту (2%).
- Решение 3: 100% н-гексан.
- Приготовьте раствор для окрашивания, смешав дистиллированную воду (90 мл) с 7,5 г медного купороса, а затем добавьте 10 мл фосфорной кислоты.
- Залейте до 5 мм каждого раствора в отдельную стеклянную камеру. Добавьте любой вид фильтровальной бумаги, чтобы увеличить скорость работы в каждой камере.
- Предварительно инкубируйте стеклянную пластину 20 x 10 см HPTLC из силикагеля 60 в первом работающем растворе до тех пор, пока рабочий раствор не достигнет верхней части пластины. Затем высушите его в течение 10 минут при 110 °C.
заметка: Эти пластины можно хранить для дальнейшего использования в алюминиевой фольге и сушить в течение 10 минут при 110 °C перед использованием.
- Растворить липидную гранулу, полученную из нейтрофилов периферической крови человека, в 200 мкл раствора хлороформа/метанола (1:1) и инкубировать в течение 15 мин при 37 °C для растворения.
- С помощью линейки и мягкого карандаша отметьте места загрузки для нужного количества образцов, плюс хотя бы один эталон. Отметьте дистанцию бега примерно 4 см и 6 см для первого и второго вариантов бега соответственно.
- Чтобы загрузить образцы, промойте шприц объемом 10 мкл 3 раза в хлороформе/метаноле (1:1) перед загрузкой каждого нового образца. Загружайте по 10 мкл каждого образца по каплям, стараясь сконцентрировать образец на как можно меньшей площади. Образцы должны быть загружены хотя бы в двух экземплярах.
- Поместите пластину вертикально в первую камеру с проточным раствором 1 (шаг 1.1.1). Убедитесь, что пластина параллельна стенке стеклянной камеры для достижения равномерной скорости миграции.
- Как только линия растворителя достигнет первой отметки, снимите пластину, высушите ее и поместите во второй раствор. Повторите аналогичные действия для второго и третьего запущенных решений; Оставьте пластину в растворе до тех пор, пока фронт растворителя не достигнет верхней части пластины, затем снимите и высушите ее при RT в течение 1 минуты.
- Поместите тарелку в раствор медного купороса на 7 с. Снимите тарелку, тщательно просушите ее и запекайте в духовке 7 мин при 170 °C. Подождите, пока тарелка остынет.
- Используя программное обеспечение для тонкослойной хроматографии и анализа гелей, а также программное обеспечение для обработки изображений, сканируйте и анализируйте для определения разрешенных полос липидов.
