Методическая статья

Микроскопия TIRF для визуализации динамики связи актина и микротрубочек

8 июля 2025 г.

В этой статье

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Источник: Henty-Ridilla, J.L., Визуализация динамики связи актина и микротрубочек in vitro с помощью микроскопии полного внутреннего отражения (TIRF). J. Vis. Exp. (2022)

Это видео описывает TIRF, метод микроскопии полного внутреннего отражения для визуализации динамики полимеризации актина и микротрубочек. Этот метод позволяет визуализировать динамику связи актина и микротрубочек с высоким разрешением в режиме реального времени, что имеет важное значение для понимания клеточных перекрестных помех.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Стирка покровных стекол

ПРИМЕЧАНИЕ: Стирка (24 мм x 60 мм, #1.5) покровные стекла согласно Smith et al., 2013.

  1. Разложите покровные листы в пластиковом контейнере для скользящей почты.
  2. Погрузите покровные стекла последовательно в следующие растворы и обработайте ультразвуком на 30-60 мин, промывая ддН2О 10 раз между каждым раствором: ддН2О с одной каплей средства для мытья посуды; 0,1 М КОН. Хранить покровные стекла в 100% этаноле до 6 месяцев><. заметка: Не прикасайтесь к стеклянным поверхностям пальцами без перчаток. Вместо этого используйте щипцы.

2. Покрытие очищено (24 мм x 60 мм, #1.5) покровными стеклами с mPEG- и биотин-PEG-силаном

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол специально использует систему биотин-стрептавидин для позиционирования актина и микротрубочек в плоскости визуализации TIRF. Могут быть использованы другие покрытия и системы (например, антитела, поли-L-лизин, NEM миозин и т.д.).

  1. Разморозьте аликвоты порошков ПЭГ-силана и биотин-ПЭГ-силана.
  2. Растворите порошки ПЭГ в 80% этаноле (pH 2,0) для получения поверхностных растворов покрытия 10 мг/мл мПЭГ-силана и 2-4 мг/мл биотин-ПЭГ-силана непосредственно перед использованием.<бр /> заметка: Порошки ПЭГ часто выглядят растворенными, но могут не находиться на микроскопическом уровне. Правильная ресуспендия занимает ~1-2 минуты при постоянном пипетировании. Пользователям рекомендуется пипетировать еще 10 раз после появления растворения порошка.
    осторожность: Надевайте перчатки для защиты кожи от концентрированной HCl при производстве 80% этанола (pH 2,0).
  3. Снимите чистый покровный колпак (24 мм x 60 мм, #1.5) с хранилища этанола с помощью щипцов. Обсушите газообразным азотом и храните в чистой чашке Петри.
  4. Покровные стекла покрыты 100 μл раствора для покрытия: смесь 2 мг/мл mPEG-силана (MW 2,000) и 0,04 мг/мл биотин-PEG-силана (MW 3,400) в 80% этаноле (pH 2,0).
    заметка: Для разреженного покрытия (рекомендуется) используйте 2 мг/мл мПЭГ-силана и 0,04 мг/мл биотин-ПЭГ-силана. Для плотного покрытия используйте 2 мг/мл мПЭГ-силана, 4 мг/мл биотин-ПЭГ-силана.
  5. Инкубировать покровные стекла при температуре 70 °C в течение не менее 18 часов или до использования.
    заметка: Покровные стекла с покрытием портятся при хранении при температуре 70 °C более 2 недель.

3. Сборка проточных камер визуализации

  1. Отрежьте 12 полос двустороннего скотча с двойной подложкой длиной 24 мм. Снимите одну сторону подложки ленты и зафиксируйте куски ленты, прилегающие к шести пазам на чистой камере визуализации><. заметка: Лента должна быть плоской для правильной сборки, в противном случае камеры для визуализации будут протекать. Осторожно снимите подложку ленты, чтобы избежать ударов. Рекомендуется сдвигать проклеенные лентой камеры по чистой поверхности до гладких контактов ленты с камерой.
  2. Снимите второй кусок подложки для ленты, чтобы обнажить липкую сторону ленты вдоль каждой канавки камеры. Положите камерный скотч вверх на чистую поверхность.
  3. Смешайте растворы эпоксидной смолы и отвердителя 1:1 (или в соответствии с инструкциями производителя) в небольшой лодке для взвешивания.
  4. С помощью наконечника P1000 поместите каплю смешанной эпоксидной смолы между полосками ленты в конце каждой канавки камеры визуализации (красная стрелка; Рисунок 1А). Положите камерный скотч/эпоксидную смолу вверх на чистую поверхность.
  5. Снимите покровную крышку с покрытием из инкубатора при температуре 70 °C. Поверхности покровного стекла и без покрытия промыть с помощью ddH2O шесть раз, высушить фильтрованным газообразным азотом, а затем прикрепить к камере визуализации стороной покрытия покровного стекла по направлению к ленте.
  6. С помощью наконечника для дозатора P200 или P1000 надавите на стык ленты и стекла, чтобы обеспечить хорошее прилегание ленты к покровному стеклу.
    заметка: При правильном уплотнении двусторонний скотч становится полупрозрачным. Камеры визуализации, в которых отсутствует достаточное количество контактов ленточной камеры, будут протекать.
  7. Инкубируйте собранные камеры при комнатной температуре не менее 5-10 минут, чтобы эпоксидная смола полностью герметизировала лунки камеры перед использованием. Срок годности перфузионных камер истекает через 12-18 часов после сборки.<бр/> заметка: В зависимости от расположения ленты и толщины используемой двусторонней ленты, собранная камера будет иметь конечный объем 20-50 мкл.

4. Кондиционирование перфузионных камер

  1. С помощью перфузионного насоса (со скоростью 500 мкл/мин) последовательно заменяйте кондиционирующие растворы в перфузионной камере следующим образом:
    1. Подайте 50 мкл 1% BSA для заполнения камеры визуализации. Удалите лишний буфер из фитингового бачка Luer-lock.
    2. Расход 50 мкл 0,005 мг/мл стрептавидина. Выдерживать 1-2 минуты при комнатной температуре. Удалите излишки буфера из резервуара.
    3. Влейте 50 мкл 1% БСА для блокирования неспецифического связывания. Инкубировать в течение 10-30 с. Удалите излишки буфера из резервуара.
    4. Расход 50 мкл теплого (37 °C) 1x буфера TIRF (1x BRB80, 50 мМ KCl, 10 мМ DTT, 40 мМ глюкозы, 0,25% (v/v) метилцеллюлозы (4,000 cp)).
      заметка: Не удаляйте излишки буфера из резервуара. Это предотвращает пересыхание камеры, что может привести к попаданию пузырьков воздуха в систему.
    5. Дополнительно: Подайте 50 μл стабилизированных и на 50% биотинилированных семян микротрубочек, разведенных в 1x буфере TIRF.
      заметка: Правильное разведение должно быть определено эмпирически и содержать вариабельность от партии к партии. Разведение с получением 10-30 семян на поле зрения хорошо работает при такой конфигурации.

5. Подготовка микроскопа

ПРИМЕЧАНИЕ: Биохимические реакции, содержащие динамические актиновые филаменты и микротрубочки, визуализируются/выполняются с помощью инвертированного флуоресцентного микроскопа с полным внутренним отражением (TIRF), оснащенного твердотельными лазерами мощностью 120-150 мВт, объективом TIRF с температурной коррекцией 63x и камерой EMCCD. Белки в этом примере визуализируются на следующих длинах волн: 488 нм (микротрубочки) и 647 нм (актин).

  1. Установите нагреватель сцены/объектива на поддержание температуры 35-37 °C не менее чем за 30 минут до получения изображения первой биохимической реакции.
  2. Задайте параметры получения изображения следующим образом:
    1. Установите интервал сбора данных каждые 5 с в течение 15-20 минут.
    2. Установите 488 и 647 лазерных экспозиций на 50-100 мс при мощности 5%-10%. Установите подходящий угол TIRF для микроскопа.
      заметка: Независимо от конфигурации микроскопа, простейшим способом установки мощности лазера, экспозиции и угла TIRF является корректировка изображений только любого полимера (см. пункты 5.2.2.1 и 5.2.2.2 ниже). Пользователям настоятельно рекомендуется использовать самые низкие настройки мощности лазера и экспозиции, которые все еще позволяют обнаруживать.
      1. Отрегулируйте реакцию полимеризации (рис. 1C), чтобы инициировать сборку актиновой нити и получить изображения с длиной волны 647 нм. Внесите соответствующие коррективы.
      2. Отрегулируйте реакцию полимеризации во второй кондиционной перфузионной лунке, чтобы инициировать сборку микротрубочек (рис. 1C) и визуализируйте при длине волны 488 нм. Внесите соответствующие коррективы.

6. Приготовление белковых реакционных смесей

  1. Приготовьте стоковый раствор из флуоресцентно меченного тубулина.
    1. Определить концентрацию самодельного немеченого тубулина с помощью спектрофотометрии на Abs280 можно следующим образом:
      1. Пустой спектрофотометр с 1хБРБ80 без ГТФ.
      2. Рассчитайте концентрацию тубулина, используя определенный коэффициент экстинкции 115 000 М-1 см-1 и следующую формулу:
        figure-protocol-1
    2. Ресуспендируйте коммерчески изготовленный лиофилизированный меченный лизином 488-тубулин до 10 мкМ (1 мг/мл; 100% метка) с 20 мкл 1x BRB80, не содержащего ГТФ.
    3. Разморозьте аликвоту объемом 7,2 мкл 100 мкМ переработанного тубулина без маркировки на льду.
      заметка: Переработанный тубулин имеет решающее значение для успешной сборки микротрубочек in vitro, поскольку он удаляет неспособные к полимеризации димеры, образующиеся в замороженных белковых запасах.
    4. Смешайте 3 мкл 10 мкМ 488-тубулина с 7,2 мкл аликвоты 100 мкМ немеченного тубулина не более чем за 15 минут до применения.
  2. Приготовьте исходный раствор флуоресцентно меченного актина.
    1. Для домашних белков определяют концентрацию и процентное содержание актина с помощью спектрофотометрии AbsAbs290 и Abs650 следующим образом:
      1. Пустой спектрофотометр с G-буфером.
      2. Рассчитайте концентрацию немеченого актина, используя определенный коэффициент экстинкции 25 974 М-1 см-1 и следующую формулу:
        figure-protocol-2
      3. Рассчитайте концентрацию меченого лизином Alexa-647-актина, используя коэффициент экстинкции немеченного актина, поправочный коэффициент на фтор, равный 0,03, и следующую формулу:
        figure-protocol-3
      4. Рассчитайте процентную метку Alexa-647-актина, используя определенный ε для Alexa-647, равный 239 000 M-1 см-1, следующим образом:
        figure-protocol-4
    2. Разморозьте одну аликвоту 2 мкЛ 3 мкМ 100% меченого биотина актина (меченного на остатках лизина). Разбавьте в 10 раз, добавив 18 мкл G-буфера.
    3. Соедините 3 мкл разбавленного биотинилированного актина и соответствующие объемы немеченного и меченого актина (выше) таким образом, чтобы конечная смесь составила 12,5 мкМ общего актина с 10%-30% флуоресцентной меткой><. заметка: Содержание более 30% флуоресцентных актиновых мономеров (конечных) может ухудшить разрешение изображения, поскольку нити становится трудно различить на фоне.
  3. Приготовьте реакционные смеси (рисунок 1В).
    1. Смесь цитоскелета (пробирка А) путем смешивания 2 мкл 12,5 мкМ актиновой смеси (6.2.3) с тубулиновой смесью (6.1.4) не более чем за 15 минут до визуализации. Хранить на льду до использования.
    2. Приготовьте белковую реакционную смесь (пробирка B), объединив все другие экспериментальные компоненты и белки, включая 2x буфер TIRF, антиотбеливатель, нуклеотиды, буферы и вспомогательные белки. Пример показан на рисунке 1C.
      заметка: В результате окончательного разведения получается 1x TIRF буфер, который содержит АТФ, ГТФ и ионную силу в пределах расчетного физиологического диапазона.
  4. Инкубируйте пробирку А и пробирку В отдельно при температуре 37 °C в течение 30-60 с. Чтобы запустить реакцию, смешайте и добавьте содержимое пробирки Б в пробирку А (ниже).

7. Динамика актина и микротрубочек изображения

  1. Хорошо кондиционируйте перфузию (Рисунок 1В; шаг 4, выше).
  2. Начните одновременную сборку актина и микротрубочек путем добавления содержимого пробирки B (реакционная смесь) в пробирку A (смесь цитоскелета) (рис. 1C).
  3. Поток 50 мкл реакции, содержащей 1x буфер TIRF, дополненный 15 мкМ свободным тубулином, 1 мМ ГТФ и 0,5 мкМ актиновыми мономерами, а также соответствующими объемами буферного контроля.
  4. Записывайте цейтраферные видеоролики с помощью программного обеспечения микроскопа каждые 5 с в течение 15-20 мин.<бр/> заметка: Инициация динамики актина и микротрубочек происходит в течение 2-5 мин (рис. 2). Более длительные задержки указывают на проблемы с контролем температуры или проблемы, связанные с концентрацией белков в реакционной смеси.
  5. Кондиционируйте новую перфузионную лунку (шаг 4) и замените объем буфера на представляющий интерес регуляторный белок(ы) (т.е. тау) и буферные регуляторы (рис. 1C). Приобретите, как описано в шаге 7 (выше), чтобы оценить регуляторные белки для возникающих функций актин-микротрубочек.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

figure-results-1
Рисунок 1. Экспериментальные схемы: сборка проточной камеры для получения изображений. (А) Узел камеры визуализации. Сверху вниз: камеры визуализации IBIDI прикреплены скотчем вдоль перфузионных лунок (обозначены стрелкой); второй (белый) слой подложки ленты (оставленный на изображении, показанном для лучшей ориентации пользователя) удаляется, а на край перфузионной камеры наносится эпоксидная смола (стрелка). Приме...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
Конфликт интересов не декларируется.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
1% BSA (w/v)Научный центр ФишераБП1600-100Для этой цели (блокировка камер TIRF) БСА ресуспендируется в ddH20 и фильтруется через фильтр 0,22 мкм.
1× BRB80самодельный80 мМ ТРУБКИ, 1 мМ MgCl2, 1 мМ EGTA, pH 6,8 с KOH
80 мМ ТРУБКИ, 1 мМ MgCl2, 1 мМ EGTA, pH 6,8 с KOHSigma Aldrich Inc, Сент-Луис, МиссуриГ2133-50КУВ сочетании с каталазой, аликвотой и хранить при -80 °C до использования
100 мкМ тубулинCytoskeleton Inc, Денвер, КолорадоТ240Домашние тубулины должны быть переработаны перед использованием для удаления неспособного к полимеризации тубулина (Hyman et al. (1992)29; Li and Moore (2020)30 ). Коммерчески доступные тубулины часто слишком разбавлены для переработки, но хорошо функционируют при ресуспендии в соответствии с инструкциями производителя и предварительной очистке с помощью ультрацентрифугирования (278 000 × г) в течение 60 минут перед использованием.
100 мМ АТФGold Biotechnology Inc, Оливетт, МиссуриА-08Ресуспендирован в ddH20 (pH 7,5) и стерилизован фильтром.
100 мМ ГТПНаучный центр ФишераAC226250010Ресуспендирован при 1× BRB80 (pH 6,8) и фильтр стерилизован.
Твердотельные лазеры мощностью 120-150 мВтLeica Microsystems11889151; 11889148
2 мг/мл каталазыSigma Aldrich Inc, Сент-Луис, МиссуриС40-100В сочетании с глюкозооксидазой, аликвотой и хранить при -80 °C до использования
2× Буфер TIRFХоуммад2× BRB80, 100 мМ KCl, 20 мМ DTT, 80 мМ глюкозы, 0,5% (v/v) метилцеллюлозы (4 000 CP); Примечание: 1 мкл 0,1М ГТФ и 1 мкл 0,1М АТФ добавляются отдельно в реакции TIRF во избежание повторных циклов замораживания-оттаивания.
24 × 60 мм, покровное стекло #1.5Fisher Scientific, Уолтем, Массачусетс22-266882 (АнглийскийПокровное стекло необходимо тщательно вымыть перед использованием (Smith et al. (2014)22 )
Тепловой блок 37 oC
Водяная баня при температуре 37 °C
5 мг/мл стрептавидина (600x стоковый)Avantor, Филадельфия, ПенсильванияРЛС000-01Ресуспендировано в Tris-HCl (pH 8,8); разбавьте аликвоту до 1× в буфере HEK в день использования
5 мин Эпоксидная смола и отвердительЛоктит, Роки-Хилл, Коннектикут1365736Для отверждения комбинированной смолы и отвердителя может потребоваться до 30 минут.
50% биотинилированные семена микротрубочек GpCppCytoskeleton Inc; СамодельныйТ333П(опционально) Стабилизированные семенами микротрубочек GppCpp или Taxol могут более эффективно опосредуть полимеризацию микротрубочек. Таксол и GppCpp стабилизируют микротрубочки различными способами, что может влиять на структуру решетки микротрубочек и способность определенных регуляторных белков связываться со стабилизированной частью микротрубочки. Метод получения различных видов семян микротрубочек описан в работе Hyman et al. (1992).
Инкубатор 70 C
Актин микс бульонДомашний; это протоколСмесь актина с концентрацией 12,5 мкМ, состоящая из меченого (флуоресцентного и биотинилированного) и немеченого актина для проведения до шести реакций. В окончательной реакции TIRF используется 2 мкл исходного материала. Конечная концентрация актина, используемого в каждой реакции, составляет 0,5 мкМ (10% Alexa-647; 0,09% меченого биотином).
Соответствующие элементы управления буферомсамодельныйКомбинация буферов из всех оцениваемых белков
Биотин-ПЭГ-силан (МВт 3 400)Лайсан Био Инкбиотин-PEG-SIL-3400Дозируют по 2-5 мг аликвоты, засыпают азотом, парапленку закрывают и хранят при -20 °C с влагопоглотителем до использования
Биотинилированный актинCytoskeleton Inc; СамодельныйАБ07Биотин-актин получают путем мечения на остатках лизина и, таким образом, предполагается, что он помечен не менее чем на 100%, но варьируется в зависимости от различных партий/препаратов. Оптимальные концентрации биотинилированного актина должны быть определены эмпирически для конкретных применений/экспериментальных дизайнов. Более высокие концентрации обеспечивают более эффективное отслеживание, но могут препятствовать полимеризации или взаимодействию с регуляторными белками. При этом небольшой процент (0,09% или 900 пМ) биотинилированного актина присутствует в конечной реакции TIRF.
Средство для мытья посудыDawn, Procter and Gamble, Цинциннати, ОгайоПо неизвестным причинам синяя версия очищает покровные стекла эффективнее других доступных цветов.
Сухой лед
Флуоресцентно меченный актинCytoskeleton Inc; СамодельныйАР05Самодельный флуоресцентно меченный актин хранится в G-буфере с добавлением 50% глицерина при -20 °C (Spudich et al. (1971) 47; Liu et al. (2022)48 ). Флуоресцентно меченный актин диализуют против G-буфера и предварительно очищают ультрацентрифугированием в течение 60 мин при концентрации 278 000 × г перед использованием.
Флуоресцентно меченный тубулинЦитоскелет ИнкTL488M, TLA590M, TL670MРесуспендирование в 20 мкл 1× BRB80 (конечная концентрация 10 мкМ) и предварительная очистка ультрацентрифугированием (278 000 × г) в течение 60 мин перед использованием.
G-буферсамодельный3 мМ Tris-HCl (pH 8,0), 0,2 мМ CaCl2, 0,5 мМ DTT, 0,2 мМ АТФ
Буфер HEKсамодельный20 мМ HEPES (pH 7,5), 1 mM EDTA (pH 8,0), 50 mM KCl
лёд
Ведро для льда
Камера визуализацииIBIDI, Фитчбург, Висконсин80666Заказывайте камеры без дна для использования различных защитных покрытий
Камера iXon Life 897 EMCCDАндор, Белфаст, Северная Ирландия8114137
Программное обеспечение для микроскопа LASX PremiumLeica Microsystems8114137
Метилцеллюлоза (4 000 cp)Сигма Олдрич ИнкМ0512
Основание микроскопа с модулем TIRFLeica Microsystems, Вецлар, Германия11889146
mPEG-силан (МВт 2 000)
)

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи