$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Проведение ежедневного выравнивания LLSM
ПРИМЕЧАНИЕ: (Важно) Этот протокол выравнивания основан на используемом инструменте LLSM (см. Таблицу материалов). Каждый LLSM может отличаться и требовать разных стратегий выравнивания, особенно тех, которые являются домашними. Выполните соответствующее обычное выравнивание и перейдите к разделу 2.
- Добавьте 10 мл воды плюс 30 мкл флуоресцеина (1 мг/мл запаса) в ванну LLSM (объем ~10 мл), нажмите кнопку Image (Home), чтобы переместить объектив в положение изображения, и посмотрите на одну диаграмму направленности лазерного луча Бесселя. Выровняйте лазерный луч с помощью направляющих и предварительно заданной области интереса (ROI), чтобы луч представлял собой тонкую структуру, сбалансированную во всех направлениях.
- Луч также должен казаться сфокусированным в камере видоискателя. Для регулировки используйте два регулятора наклона зеркала, верхний микрометр, фокусировку и кольцо для объектива излучения. Правильно выровненный луч см. на рисунках 1, А и В.
- Вымойте ванну и объективы не менее чем 200 мл воды, чтобы полностью удалить флуоресцеин.
- Изображение стандартных флуоресцентных шариков на носителях изображения (полученных путем приклеивания бусин к покровному стеклу толщиной 5 мм с поли-L-лизином, см. Таблицу материалов; это может быть предварительно подготовлено и использовано повторно) для выполнения функции физического растекания точки (PSF) в средах визуализации.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для последующей обработки в поле зрения может быть только одна бусина, поэтому постарайтесь найти бусину, которая сама по себе находится в просмотрщике или может быть легко обрезана для получения одной бусины.
- Включите дизеринг, установив его значение на 3 в поле «X Galvo range». Нажмите Live, чтобы просмотреть текущее поле. Двигайтесь по оси Z, чтобы найти покровную крышку и бусины. Найдите центр бусины, двигаясь по Z, нажмите Stop, чтобы приостановить лазер. Проверьте 3D, нажмите Центр, а затем нажмите Выполнить. Это позволит собрать данные.
- Вручную отрегулируйте зеркало наклона, воротник объектива и микрометр фокусировки для получения максимальных значений серого, а затем отрегулируйте по мере необходимости, чтобы получить правильные шаблоны для режимов сканирования объектива, z galvo, z+objective (totPSF) и сканирования образцов (samplePSF). На рисунке 1 C-F приведены правильно отрегулированные проекции максимальной интенсивности (MIP).
заметка: Различные режимы съемки (сканирование с объективом, сканирование по z+объективу, сканирование с помощью образца) изменяют способ перемещения светового листа по образцу. Для юстировки следует использовать все режимы сканирования.
- Образец сканирования показывает, как будут собираться данные во время эксперимента. Соберите образец PSF, нажав Execute в режиме сканирования образца для выравнивания и деконволюции. Переключите лазеры на три цветовых режима (488, 560, 647) и нажмите Execute еще раз.
заметка: Поскольку изображения LLSM находятся под углом (57,2°), изображения, полученные в режиме «сканирования образца», собираются под этим углом и, следовательно, имеют «перекос». Устранение перекоса — это процесс коррекции этого угла и «повторного выравнивания» изображения в соответствии с истинным z-стеком. Эти данные должны быть собраны на носителях визуализации и во всех каналах, которые будут визуализироваться во время эксперимента. Если эти данные не будут собраны должным образом, данные не будут должным образом удалены. Аналогичным образом, убедитесь, что среда была нагрета до 37 °C (или желаемой экспериментальной температуры).
2. Настройка ячеек с помощью LLSM
- Добавьте 100 000 антигенпрезентирующих клеток (APC) (50 μL) в круглую покровную крышку диаметром 5 мм и дайте им отстояться в течение 10 минут.
- Смажьте держатель образца маслом, затем приложите к нему покровную крышку стороной вверх. Добавьте каплю носителя для визуализации на заднюю часть покровного стекла, чтобы избежать образования пузырей, прежде чем помещать его в ванну. Накрутите держатель образца на пьезо и нажмите Image (Home).
- Найдите APC для создания изображений, чтобы убедиться, что LLSM и программное обеспечение для визуализации (см. Таблицу материалов) работают правильно.
заметка: Мы получаем изображение с шагом 0,4 мкм с 60 z-шагами и экспозицией 10 мс для двух цветов с дизерингом, установленным на 3, что дает 1,54 с на кадр 3D-изображения с разрешением ~200 нм XY и 400 нм Z. Эти настройки могут потребоваться для корректировки в зависимости от размера ячейки, желаемого z-разрешения и силы сигнала, полученного с помощью используемого метода флуоресцентного мечения. Потребляемая мощность лазера также будет варьироваться в зависимости от используемой техники флуоресцентного мечения.
- Нажмите «Онлайн», чтобы просмотреть текущее изображение. Двигайтесь по Z, чтобы найти покровную крышку и ячейки.
- Найдите центр БТР, двигаясь в направлении Z, затем нажмите Stop, чтобы приостановить лазер. Проверьте 3D и введите нужные настройки, нажмите Центр, а затем нажмите Выполнить. Это позволит собрать данные.
- Опустите предметное столико до положения загрузки и добавьте 50 μL Т-клеток в среду визуализации (100 000 клеток) по каплям непосредственно на покровное стекло. Лучше всего дать капле образоваться на конце наконечника пипетки, а затем прикоснуться кончиком к жидкости для ванны. Поднимите сцену назад, нажав "Изображение (Возврат)".
- Начните визуализацию. Обязательно установите желаемый размер стопки и длину интервальной съемки. Например, представьте себе 60 z-стеков с шагом 0,4 мкм и введите 500 таймфреймов. (Обычно) останавливайте запись до достижения 500 кадров, чтобы избежать фотообесцвечивания. Используйте режим Live для поиска пар ячеек, а когда готовые и желаемые настройки будут введены, нажмите Execute для сбора данных. Пример приведен на рисунке 2.
