$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Подготовка предметного стекла микроскопа
ПРИМЕЧАНИЕ: В экспериментах SPT используются элементы U87 MG третьего-десятого поколений с высокой активностью.
- Уже очищенные раствором «Пиранья» покровные стекла 22 мм × 22 мм простерилизовать, погрузив в этанол (99,9%).
- С помощью щипцов извлеките защитную пленку из раствора этанола (шаг 1.1) и простерилизуйте, сжигая этанол на пламени. После того, как весь этанол будет сожжен, поместите покровные стекла в пластиковую чашку для клеточных культур (35 x 10 мм), наполненную 2 мл клеточной среды (без фенольного красного).
- Добавьте 50 μL клеточной суспензии на покровную крышку и осторожно двигайте чашку вперед и назад, влево и вправо, чтобы равномерно распределить ячейки. Поместите его во влажную атмосферу.
- Когда ячейки U87 MG на покровном стекле достигнут конфлюенции 20–40% (~12 ч), добавьте в чашку 20 мкл CTAB-AuNRs (золотые наностержни, синтезированные с молекулой бромида аммония цетилтриметиламмония в качестве защитного агента, 138 пМ) и диспергируйте. Инкубировать во влажной атмосфере в течение 5 минут.
- Добавьте 100 мкл питательной среды (без фенольного красного) из чашки на шаге 1.4 в углубление рифленого предметного стекла (рис. 1), которое предварительно очищают раствором пираньи.
- Выньте покровное стекло из чашки и переверните его в верхней части канавки предметного стекла микроскопа (рисунок 1). Заклейте его лаком для ногтей, дайте ему высохнуть и поставьте на сцену для проведения экспериментов SPT.
2. Проведение экспериментов по отслеживанию отдельных частиц с помощью темнопольной микроскопии (Рисунок 1).
- Нанесите каплю масла на погружённый в масло конденсатор темного поля (числовая апертура (NA) 1,43-1,20) и поверните ручку, чтобы конденсатор соприкоснулся со стеклопакетом.
- Нанесите каплю масла на верхнюю часть защитного стекла и поверните ручку фокусировки так, чтобы объектив с 60-кратным погружением в масло (NA 0,7–1,25) коснулся масла.
- Включите источник света и слегка поверните ручку фокусировки, чтобы сфокусироваться на плоскости изображения.
заметка: В поле зрения фон черный, ячейки яркие, а CTAB-AuNR (соотношение сторон ~2:1, Рисунок 2) представляют собой небольшие цветные (красные, желтые или зеленые) рассеивающие пятна.
- Захват образца рассеянного света с помощью цветной CMOS-камеры. Нажмите на значок «Камера» в программном обеспечении, чтобы записать и экспортировать формат TIFF для сохранения изображений.
3. Сбор данных
- Выделение единой долгосрочной траектории
- Работайте, как описано на рисунке 3, чтобы преобразовать темные изображения временных рядов из режима «RGB color» в режим «8 бит». На изображении J нажмите Изображение | Тип | 8 бит. Чтобы настроить контрастность, нажмите Изображение | Настройка | Яркость | Контраст.
- Выберите целевую частицу и отрежьте фон временного ряда, упаковав и удалив фон с помощью клавиш "Ctrl+X".
- Откройте окно обнаружения частиц и связывания частиц, нажав на кнопку "Плагины | Трекер частиц Классика | Трекер частиц».
- Установите Radius на 6, Cutoff на 0 и Percentile на 0.01%.
заметка: Чтобы обнаружить частицу, настройте три вышеуказанных параметра с помощью функции предварительного просмотра. Убедитесь, что радиус немного больше целевой частицы и меньше, чем наименьшее расстояние между частицами. Процентиль — это нижняя граница распределения интенсивности, которая может быть частицами-кандидатами.
- Установите Link Range на 5 и Displacement на 10.
заметка: Чтобы связать частицу между последовательными соседними кадрами, настройте два вышеуказанных параметра. Смещение — это максимальное количество пикселей, на которое частица может переместиться между двумя последующими кадрами, а диапазон связи — это количество последовательных кадров, которое следует учитывать при определении наилучшего соответствующего соответствия.
- Нажмите «ОК», чтобы открыть окно результатов ParticleTracker и увидеть результаты.
- Нажмите «Визуализировать все траектории», чтобы просмотреть сгенерированные траектории.
- Нажмите меню «Повторно связать частицы» вверху, чтобы повторно связать обнаруженные частицы с различными диапазонами связи и процентильными параметрами, если сгенерированная программным обеспечением траектория не совпадает с траекторией движения AuNR.
- Нажмите «Сохранить полный отчет», чтобы сохранить результаты, если траектория, сгенерированная программным обеспечением, и траектория движения AuNR совпадают.
ПРИМЕЧАНИЕ: Пример извлечения одной долгосрочной траектории с помощью изображения J показан на рисунке 4.
