Интерференционно-отражательная микроскопия для безметочной визуализации динамики микротрубочек

Abstract

Источник: Mahamdeh, M., et al. Реализация интерференционно-отражательной микроскопии для высокоскоростной визуализации микротрубочек без меток. J. Vis. Exp. (2019).

В этом видео мы описываем метод интерференционно-отражательной микроскопии (IRM) для визуализации микротрубочек, растущих на поверхности покровного стекла в присутствии подходящего буфера. При освещении падающим светом интерфейс покровного стекла-буфера и интерфейс буфер-микротрубочка отражают свет, который в совокупности создает интерференционную картину, позволяющую визуализировать микротрубочки в виде высококонтрастных изображений на ярком фоне.

Protocol

1. Модификация микроскопа и объектива

1. Вставьте зеркало 50/50 в колесо фильтра флуоресцентного микроскопа с помощью соответствующего фильтрующего куба (рис. 1). Обращайтесь с зеркалом 50/50 с осторожностью, так как часто они имеют антибликовое покрытие.
   заметка: Мы использовали зеркало 50/50 в пустом фильтрующем кубе микроскопа. Зеркало 50/50 вставляется в то место, где находится дихроичное зеркало.
2. Используйте масляный объектив с большим увеличением и большой числовой апертурой (NA).
   заметка: В этом протоколе мы использовали объектив 100x/1.3 NA.

Results

Рисунок 1. Схематическое изображение IRM. (A) Эпиосвещение от источника света проходит через апертурную диафрагму, прежде чем достичь зеркала 50/50. Апертурная диафрагма задает ширину луча, а значит, освещенность NA. Зеркало 50/50 частично отражает свет вверх к объективу для освещения образца. Свет, отраженный от образца, собирается, а затем проецируется на чип камеры (с помощью объектива трубки), где он создает помехи для создания .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
микроскоп	Компания Nikon	Ti-Eclipse	Инвертированный микроскоп, используемый для проведения исследований
Светоделитель 50/50	Цветность	21000	При покупке обязательно выбирайте размеры разделителя, которые соответствуют кубу, используемому в микроскопе
Объектив NIKON PLAN FLUOR 100X/0.5-1.3 Iris	Компания Nikon	MRH02902	Объектив визуализации. Эта цель имеет корректирующую радужную оболочку глаза, которая была открыта до NA 1.3
Универсальное моющее средство Mucasol	Сигма-Олдрич	Z637181-2л	Используется для чистки покровных стекол и горок
Пластиковая парафиновая пленка (коммерческое название Parafilm M)	Сигма-Олдрич	П7793	Используется для строительства проточных каналов
Антитела против TAMRA	Инвитроген	А-6397	Используется для связывания меченых TAMRA молекул (например, микротрубочек) с поверхностью образца. РРИД (AB_2536196)
Poloxamer 407 (коммерческое название Pluronic F-127)	Сигма-Олдрич		Используется для блокировки поверхности канала для предотвращения неспецифического связывания
Наночастицы золота 40 нм	Сигма-Олдрич	753637	Используется в качестве контрольного образца
Наночастицы золота 20 нм	Сигма-Олдрич	753610 (Английский	Используется в качестве контрольного образца
Камера Zyla 4.2	Андор	Зайла 4.2	2048x2048 пикселей (размер пикселя 6,5 мкм) с квантовой эффективностью 72% и динамическим диапазоном 16 бит
Программное обеспечение для отслеживания Feista			https://www.bcube-dresden.de/ fiesta/wiki/FIESTA
Стабилизированные микротрубочки			Подготовлено внутри компании (см. ссылки в тексте)