$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Модификация микроскопа и объектива
- Вставьте зеркало 50/50 в колесо фильтра флуоресцентного микроскопа с помощью соответствующего фильтрующего куба (рис. 1). Обращайтесь с зеркалом 50/50 с осторожностью, так как часто они имеют антибликовое покрытие.
заметка: Мы использовали зеркало 50/50 в пустом фильтрующем кубе микроскопа. Зеркало 50/50 вставляется в то место, где находится дихроичное зеркало.
- Используйте масляный объектив с большим увеличением и большой числовой апертурой (NA).
заметка: В этом протоколе мы использовали объектив 100x/1.3 NA.
2. Подготовка камеры для прикрепления микротрубочек к поверхности
- Очистите предметные стекла микроскопа и покровные накладки 22 мм x 22 мм (для вертикального микроскопа) или покровные стекла 22 мм x 22 мм и 18 мм x 18 мм (для инвертированных микроскопов). При необходимости измените поверхность. Например, очистите покровные стекла с помощью щелочного моющего средства (см. Таблицу материалов), а затем 100% этанола с промывкой дистиллированной водой между и после.
- Отрежьте полоски пластиковой парафиновой пленки шириной 3 мм (см. Таблицу материалов) с помощью лезвия бритвы и другого предметного стекла микроскопа в качестве края.
- Поместите две полоски пластиковой парафиновой пленки на расстоянии 3 мм друг от друга на чистую крышку размером 22 x 22 мм. Затем поместите покровное стекло размером 18 мм x 18 мм, чтобы образовался канал. Если вы используете вертикальный микроскоп, поместите полоски поверх чистого предметного стекла микроскопа, а затем наденьте сверху покровную крышку.
- Поместите защитное стекло (или предметное стекло) на термоблок при температуре 100 °C на 10-30 с, чтобы парафиновая пленка образовала герметичный канал.
- Введите 50 мкг/мл антитела (в Brinkley Buffer 1980 (BRB80)) путем перфузии с помощью пипетки. Инкубировать в течение 10 мин.<бр/>
заметка: Мы используем антитела против родамина для связывания меченых родамином семян микротрубочек с поверхностью. В качестве альтернативы авидин может быть использован для связывания меченых биотином семян микротрубочек или с биотинилированными частицами золота. Чтобы просто посмотреть на микротрубочки в отсутствие тубулина в растворе (т.е. с помощью нединамического анализа), можно использовать антитела против тубулина.
- Промойте пять раз буфером BRB80. Рекомендуется фильтровать растворы с помощью фильтра 0,22 мкм.
- Влейте 1% полоксамер 407 (триблокный сополимер) в BRB80 для блокировки поверхности от неспецифического связывания. Выдерживать в течение 10 минут.
- Промойте пять раз буфером BRB80.
- Образец готов к размещению на микроскопе. Чтобы предотвратить высыхание образца, добавьте две капли буфера BRB80 на концах канала и пополняйте его по мере необходимости.
3. Юстировка микроскопа
- Поместите образец на предметный столик микроскопа. Включите источник света эпиподсветки.
- Сосредоточьтесь на поверхности образца. Вы будете наблюдать несколько поверхностей при перемещении объектива вверх и вниз из-за обратного отражения света от оптики в оптическом пути. Хороший способ найти поверхность образца — сосредоточиться на краю парафиновой пленки. Как только поверхность будет найдена, установите поле зрения на центр камеры.
- Центрируйте диафрагму по полю зрения, закрыв ее наполовину и с помощью регулировочных винтов. После выравнивания снова откройте диафрагму.
заметка: Регулировку винтов необходимо выполнять только время от времени, возможно, каждые 3-6 месяцев или при устранении неполадок.
- Вставьте линзу Бертрана, чтобы увидеть выходной зрачок (заднюю фокальную плоскость) объектива.
- Закройте апертурную диафрагму (AD) за краями выходного зрачка объектива.
- С помощью регулировочных винтов отцентрируйте AD по выходному зрачку. Перепроверьте, открыв AD и совместив его края с краями выходного зрачка.
заметка: Эту корректировку нужно выполнять только время от времени.
- Установите диафрагму апертуры примерно на 2/3 от NA объектива.
4. Визуализация стабилизированных микротрубочек или частиц золота с длиной волны 40 нм
ПРИМЕЧАНИЕ: Стабилизированные микротрубочки и наночастицы золота служат хорошими контрольными образцами. Рекомендуется визуализировать прикрепленные к поверхности микротрубочки или наночастицы золота в качестве первого шага для оценки производительности IRM и помощи в настройке оптимального отверстия апертурной диафрагмы (раздел 7).
- Установите время экспозиции камеры на 10 мс и отрегулируйте освещение так, чтобы он практически заполнил динамический диапазон камеры.
- Подайте 10 мкл гуанилил-(альфа, бета)-метилендифосфоната (GMPCCP) или стабилизированных таксолом микротрубочек в BRB80 (или частицах золота с длиной волны 40 нм) путем перфузии с помощью пипетки в свежий образец и контролируйте связывание путем визуализации поверхности. После того, как 10-20 микротрубочек будут связаны в поле зрения, промойте образец 2 раза BRB80.
заметка: С помощью хорошо выровненного микроскопа микротрубочки должны быть видны без вычитания фона.
- Получите 10 изображений, установив интервальную съемку с интервалом в 1 секунду на 10 секунд (при выдержке 10 мс).
- Приобретите фоновое изображение. Для этого переместите сцену с помощью контроллера сцены или компьютерного программного обеспечения вдоль оси длиной канала, получая при этом 100 изображений без задержки (т.е. с частотой около 100 кадров в секунду @ 10 мс экспозиции).
заметка: Фон — это медиана из 100 изображений. При взятии медианы профиль освещенности и другие неподвижные характеристики, такие как грязь на оптике, сохраняются, в то время как все остальное отфильтровывается. На образце не должно быть наклона, так как это приведет к изменению осевого положения при перемещении предметного столика и в конечном итоге приведет к ухудшению фонового изображения. Если наклона избежать не удается, то альтернативным методом является получение усредненных фоновых изображений до того, как семена будут расфасованы.
- Для обработки и анализа изображений перейдите к шагу 6.
5. Визуализация динамики микротрубочек
- Для динамики микротрубочек с помощью тубулина мозга установите температуру нагревателя образца на 37 °C.
- Влейте 10 мкл стабилизированных GMPCCP семян микротрубочек в BRB80 путем перфузии с помощью пипетки в свежий образец и контролируйте их связывание с поверхностью, визуализируя поверхность в реальном времени (т. е. во время потоковой передачи). После того, как 10-20 семян свяжутся с полем зрения, промойте образец с использованием 2-кратного объема канала с BRB80 (BRB80 следует предварительно нагреть до 37 °C или хотя бы при комнатной температуре).
заметка: При хорошо выровненном микроскопе семена должны быть видны без вычитания фона.
- Протекание в полимеризационной смеси (7,5 мкМ немеченого тубулина + 1 мМ гуанозинтрифосфата (ГТФ) + 1 мМ дитиотреитола (ДТТ) в буфере BRB80). Для измерения роста микротрубочек установите интервальную съемку с помощью программного обеспечения для сбора данных для получения изображения каждые 5 секунд (0,2 кадра в секунду (fps)) в течение 15 минут.
- Чтобы усилить контрастность, получите 10 изображений (вместо одного) в каждой временной точке и усредните их. Для уменьшения микротрубочек можно получать изображения со скоростью 100 кадров в секунду, установив временную задержку на 0 и время экспозиции на 10 мс (более высокая частота кадров в секунду возможна с меньшими областями интереса в зависимости от используемой камеры).
- Получите фоновое изображение, как в шаге 4.4.
6. Обработка и анализ изображений
ПРИМЕЧАНИЕ: Для анализа этот протокол использует Фиджи, но читатель волен использовать любое программное обеспечение, которое он считает подходящим.
- Откройте сохраненные фоновые изображения.
- Рассчитайте медианное изображение (т. е. фон) с помощью Image > Stack > Z project > Median.
- Откройте фильм о динамике микротрубочек в виде стопки (то же самое для нединамических микротрубочек) с помощью команды «Файл» > «Открыть».
- Вычтите фоновое изображение из стека с помощью калькулятора обработки > изображений. Обязательно отметьте опцию "32bit (float) result".
- Для динамических микротрубочек с помощью инструмента «Линия» проведите линию вдоль интересующей микротрубочки и добавьте ее в диспетчер интересующей области, нажав клавишу «t». Повторите для всех интересующих вас микротрубочек.
- Для динамических микротрубочек запустите макрос Multi-Kymo. Макрос сгенерирует видео и кимограф для каждой микротрубочки в менеджере ROI. Каждая микротрубочка получит уникальный идентификатор.
- Для динамических микротрубочек запустите макрос Kymo-Analysis и следуйте его шагам, чтобы измерить темпы роста и сокращения микротрубочек.
7. Размер диафрагмы апертуры
ПРИМЕЧАНИЕ: Важным фактором для получения высококонтрастных изображений микротрубочек с помощью IRM является правильная настройка числовой апертуры освещения (INA). INA может быть изменена путем изменения размера входящего светового луча в выходном зрачке объектива, который контролируется размером AD (AD расположен в сопряженной плоскости с выходным зрачком (задней фокальной плоскостью) объектива, рис. 1):
где DAD - диаметр апертурной диафрагмы,f объектив - фокусное расстояние объектива, а Dep - диаметр выходного зрачка объектива. Как правило, AD остается полностью открытым для флуоресцентной визуализации, поэтому INA равна NA объектива. В флуоресцентном микроскопе шкала AD не указывает на его диаметр, поэтому INA не может быть рассчитана. Откалибровать размер AD можно с помощью объектива. Тем не менее, в этом нет необходимости, так как размер AD будет зафиксирован на размере, который обеспечивает наибольший контраст.
- Подготовьте образец флуоресцентно меченых стабилизированных микротрубочек, прикрепленных к поверхности (шаги 4.1-4.2).
заметка: Мы использовали меченые тетраметилродамином микротрубочки (Ex: 550 нм, Em: 580 нм).
- Сфокусируйте микротрубочки с помощью ручки фокусировки микроскопа во время флуоресцентной визуализации (если микротрубочки не помечены, визуализируйте их с помощью IRM или DIC).
- Установите выдержку камеры равной 10 мс с помощью программного обеспечения камеры.
заметка: Эта экспозиция произвольна, и выдержка в 100 мс также подойдет.
- Закройте AD до самого маленького отверстия. Отрегулируйте освещение так, чтобы оно почти полностью заполнило динамический диапазон камеры или достигло максимально возможного.
заметка: В качестве руководства используйте таблицу поиска, обычно предоставляемую программным обеспечением для сбора данных.
- Получите 10 изображений (путем потоковой передачи или съемки изображения каждую секунду) поля зрения, содержащего 10+ микротрубочек.
- Получите фоновое изображение, как в шаге 4.4.
- Измените размер AD и повторите шаги 7.5-7.6 для всего диапазона раскрытия AD (от закрытого до размера выходного зрачка, рисунок 2). Каждый раз при изменении размера AD регулируйте интенсивность освещения в соответствии с шагом 7.4.
- Для каждого полученного поля зрения вычтите соответствующий фон с помощью калькулятора > изображений и выбрав «вычесть» из выпадающего меню. Убедитесь, что отмечена опция "32bit (float) result". Затем усредните полученные изображения с помощью изображения > стек > Z-проект> усредните.
- Измерьте отношение сигнал/фоновый шум (SBR) микротрубочек, определяемое как средняя интенсивность сигнала микротрубочек (интенсивность микротрубочки минус интенсивность фона), деленная на стандартное отклонение фона (рис. 3).
- Определите оптимальный размер AD (т.е. оптимальный INA), рассчитав среднее значение SBR микротрубочек для каждого размера отверстия, и установите размер AD на тот, который дает наибольший SBR (рис. 2). Вполне возможно, что существует диапазон размеров AD, которые дают сопоставимый контраст.
