Статическая атомно-силовая микроскопия для визуализации и определения характеристик собранных нуклеосом

Аннотация

Источник: Stormberg, T., et al. Исследование структуры и динамики нуклеосом с помощью атомно-силовой микроскопии. J. Vis. Exp.(2019)

В этом видео мы демонстрируем статическую атомно-силовую микроскопию для визуализации собранных нуклеосом. Этот метод визуализации с высоким разрешением позволяет изучать структуру нуклеосом.

Протокол

1. Функционализация поверхности слюды для статической АСМ визуализации нуклеосом

1. Приготовьте 50 мМ 1-(3-аминопропил) силатрановый раствор APS в деионизированной воде, как описано. Храните 1 мл аликвот этого раствора при температуре 4 °C до использования.
   заметка: Аликвоты могут храниться более года при температуре 4 °C.
2. Приготовить рабочий раствор APS 1:300 для модификации слюды путем растворения 50 мкл из 50 мМ запаса APS в 15 мл dd H₂O.
   заметка: Этот рабочий раствор можно хранить при комнатной температуре в течение нескольких дней.
3. Вырежьте полоски слюды размером 1 х 3 см из высококачественных листов слюды (см. Таблицу материалов для используемой слюды здесь).
   1. Убедитесь, что изделие подходит при размещении по диагонали в кювете. Используйте кончик острого пинцета, лезвие бритвы или скотч, чтобы расщепить слои слюды до тех пор, пока обе стороны не станут свежераскалывающимися, а кусок не станет толщиной ~0,1 мм (Рисунок 1A). Немедленно поместите кусочек слюды в кювету, наполненную APS, и инкубируйте в течение 30 минут (рисунок 1B).
4. Переложите кусочек слюды в кювету, наполненную dd H2O, и замочите на 30 с (рисунок 1C). Полностью высушите обе стороны полоски APS-слюды под потоком аргона.
   заметка: Нетканая салфетка из целлюлозы и полиэстера для чистых помещений (рекомендуется использовать салфетку для чистых помещений, указанная в материалах) может быть использована для отвода воды с края слюды во время сушки.
5. Теперь используйте сухую полоску слюды для подготовки образца. В противном случае храните изделие в чистой сухой кювете (Рисунок 1D).
   заметка: Дополнительное хранение в вакууме в течение 1-2 часов рекомендуется при влажной окружающей среде. Протокол можно поставить на паузу здесь.

2. Подготовка образцов нуклеосом на APS-слюде для статической АСМ визуализации

1. Наклейте двусторонний скотч на несколько магнитных шайб и расположите их в стороне.
2. Обрежьте подложку из APS-слюды до нужного размера (квадраты 1 x 1 см для используемого здесь инструмента MM AFM). Поместите эти кусочки в чистую чашку Петри и держите их накрытыми.
3. Готовят три разведения собранных нуклеосом (конечные концентрации нуклеосом 0,5, 1,0 и 2,0 нМ) с использованием фильтрованного буфера массой 0,22 мкм, содержащего 10 мМ HEPES pH 7,5 и 4 мМ MgCl₂,<бр/> заметка: Чтобы ограничить потерю нуклеосом при низкой конечной концентрации, разведения следует проводить по одному, непосредственно перед осаждением на APS-слюду.
4. Поместите 5-10 μL разведенного образца нуклеосом в центр кусочка APS-слюды и дайте ему инкубироваться в течение двух минут. Аккуратно промойте образец 2-3 мл dd H₂O, чтобы удалить все компоненты буфера. После использования каждого ~0,5 мл dd H₂O осторожно встряхните слюду, чтобы удалить излишки промывочной воды.
   заметка: Для этого этапа полоскания рекомендуется использовать одноразовый шприц.
5. Высушите осажденный образец под легким потоком чистого газообразного аргона.
   заметка: Теперь образец готов к визуализации или может храниться в вакуумном шкафу или эксикаторе, заполненном аргоном. Образцы, подготовленные и хранящиеся в соответствии с описанием, были сфотографированы через год после подготовки без потери качества. Протокол можно поставить на паузу здесь.

3. Статическая АСМ визуализация нуклеосом

1. Установите наконечник AFM на держатель наконечника. Используйте наконечник с пружинной постоянной ~40 Н/м и резонансной частотой от 300 до 340 кГц (см. Таблицу материалов для используемых здесь консолей).
2. Устанавливайте изготовленный в разделе 3 образец на столик АСМ, стараясь не соприкасаться с поверхностью образца.
3. Расположите лазер над консолью до тех пор, пока сумма не достигнет максимума, и отрегулируйте значения вертикального и бокового отклонения почти до нуля.
4. Настройте зонд АСМ на определение его резонансной частоты и отрегулируйте амплитуду привода, а также установите размер изображения 100 x 100 нм. Нажмите кнопку «Включить», чтобы начать подход.
5. После приближения постепенно оптимизируйте заданное значение амплитуды до тех пор, пока поверхность образца не станет четко видна. Увеличьте размер сканирования до 1 x 1 μm и разрешение до 512 x 512 пикселей. Нажмите кнопку захвата, а затем кнопку вовлечения, чтобы начать получение изображения.
   заметка: Изображения на рисунке 2 показывают гладкий фон, который можно ожидать при визуализации этих образцов.

Результаты

Рисунок 1: Схема процесса получения функционализованной АФС слюды для АСМ визуализации нуклеосом. (А) кусок слюды толщиной ~0,1 мм имеет обе стороны свежерасщепленными. (B) Расщепленный кусочек слюды немедленно помещают по диагонали в кювету, содержащую раствор APS, и устанавливают на инкубацию в течение 30 мин. (C) После этапа функционализации APS кусочек слюды APS переносят в кювету, наполненную dd H2O, для полоск...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
CENP-A/H4)2, рекомбинантный человек	EpiCypher, Дарем, Северная Каролина	16-0010	Каталожный номер для 50 мкг
H2A/H2B, рекомбинантный человек	EpiCypher, Дарем, Северная Каролина	15-0311	Каталожный номер для 50 мкг
H3 Октамер, рекомбинантный человек	EpiCypher, Дарем, Северная Каролина	16-0001 (Английский	Каталожный номер для 50 мкг
Комплект диализных аппаратов Slide-A-Lyzer MINI, 10K MWCO, 0,1 мл	ThermoFischer Scientific, Уолтем, Массачусетс	No 69574	Каталожный номер на 10 устройств
Хлорид натрия	Сигма-Олдрич, Сент-Луис, Миссури	С9888-500Г	Каталожный номер для 500 мг
Центробежные фильтры Amicon Ultra-0,5 мл	Millipore-sigma, Берлингтон, Миссури	UFC501008	Каталожный номер на 8 устройств
список совместимого оборудования	Сигма-Олдрич, Сент-Луис, Миссури	258148-25МЛ	Каталожный номер для 25 мл
Трицин	Сигма-Олдрич, Сент-Луис, Миссури	Т0377-25Г	Каталожный номер для 25 г
Паспорт безопасности	Сигма-Олдрич, Сент-Луис, Миссури	11667289001	Каталожный номер за 1 кг
Персульфат аммония (AmmPS)	Bio-Rad, Геркулес, Калифорния	1610700 (Английский	Каталожный номер для 10 г
30% раствор акриламида/биса, 37,5:1	Bio-Rad, Геркулес, Калифорния	1610158	Каталожный номер для 500 мл
ТЕМЕД	Bio-Rad, Геркулес, Калифорния	1610800 (Английский	Каталожный номер для 5 мл
4x Буфер для образцов белка Laemmli для SDS-PAGE	Bio-Rad, Геркулес, Калифорния	1610747	Каталожный номер для 10 мл
2-МЕ	Сигма-Олдрич, Сент-Луис, Миссури	М6250-10МЛ	Каталожный номер для 10 мл
ageRuler Предварительно окрашенный протеиновый лестник	ThermoFischer Scientific, Уолтем, Массачусетс	No 26616	Каталожный номер для 500 мкл
Биобезопасное™ пятно для кумасси	Bio-Rad, Геркулес, Калифорния	1610786	Каталожный номер на 1 л
Нетканые салфетки для чистых помещений: TX604 TechniCloth	TexWipe, Кернерсвиль, Северная Каролина	ТХ604
Слюда из блока Московит	AshevilleMica, Ньюпорт-Ньюс, Вирджиния	Класс-1
ХЕПЕС	Сигма-Олдрич, Сент-Луис, Миссури	Н4034-25Г	Каталожный номер для 25 г
Скотч	Scotch-3M, Сент-Пол, Миннесота
Асм-зонд TESPA-V2 (для статической визуализации)	Зонды Bruker AFM, Камарильо, Калифорния
Фильтр Millex-GP, 0,22 мкм	Сигма-Олдрич, Сент-Луис, Миссури	SLGP05010	Каталожный номер на 10 устройств
Щуп BL-AC10DS-A2 AFM (для HS-AFM)	Олимп, Япония
Многорежимный атомно-силовой микроскоп	Bruker-Nano/Veeco, Санта-Барбара, Калифорния

) ) )