Method Article

Статическая атомно-силовая микроскопия для визуализации и определения характеристик собранных нуклеосом

July 8th, 2025

In This Article

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Источник: Stormberg, T., et al. Исследование структуры и динамики нуклеосом с помощью атомно-силовой микроскопии. J. Vis. Exp.(2019)

В этом видео мы демонстрируем статическую атомно-силовую микроскопию для визуализации собранных нуклеосом. Этот метод визуализации с высоким разрешением позволяет изучать структуру нуклеосом.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Функционализация поверхности слюды для статической АСМ визуализации нуклеосом

  1. Приготовьте 50 мМ 1-(3-аминопропил) силатрановый раствор APS в деионизированной воде, как описано. Храните 1 мл аликвот этого раствора при температуре 4 °C до использования.
    заметка: Аликвоты могут храниться более года при температуре 4 °C.
  2. Приготовить рабочий раствор APS 1:300 для модификации слюды путем растворения 50 мкл из 50 мМ запаса APS в 15 мл dd H2O.
    заметка: Этот рабочий раствор можно хранить при комнатной температуре в течение нескольких дней.
  3. Вырежьте полоски слюды размером 1 х 3 см из высококачественных листов слюды (см. Таблицу материалов для используемой слюды здесь).
    1. Убедитесь, что изделие подходит при размещении по диагонали в кювете. Используйте кончик острого пинцета, лезвие бритвы или скотч, чтобы расщепить слои слюды до тех пор, пока обе стороны не станут свежераскалывающимися, а кусок не станет толщиной ~0,1 мм (Рисунок 1A). Немедленно поместите кусочек слюды в кювету, наполненную APS, и инкубируйте в течение 30 минут (рисунок 1B).
  4. Переложите кусочек слюды в кювету, наполненную dd H2O, и замочите на 30 с (рисунок 1C). Полностью высушите обе стороны полоски APS-слюды под потоком аргона.
    заметка: Нетканая салфетка из целлюлозы и полиэстера для чистых помещений (рекомендуется использовать салфетку для чистых помещений, указанная в материалах) может быть использована для отвода воды с края слюды во время сушки.
  5. Теперь используйте сухую полоску слюды для подготовки образца. В противном случае храните изделие в чистой сухой кювете (Рисунок 1D).
    заметка: Дополнительное хранение в вакууме в течение 1-2 часов рекомендуется при влажной окружающей среде. Протокол можно поставить на паузу здесь.

2. Подготовка образцов нуклеосом на APS-слюде для статической АСМ визуализации

  1. Наклейте двусторонний скотч на несколько магнитных шайб и расположите их в стороне.
  2. Обрежьте подложку из APS-слюды до нужного размера (квадраты 1 x 1 см для используемого здесь инструмента MM AFM). Поместите эти кусочки в чистую чашку Петри и держите их накрытыми.
  3. Готовят три разведения собранных нуклеосом (конечные концентрации нуклеосом 0,5, 1,0 и 2,0 нМ) с использованием фильтрованного буфера массой 0,22 мкм, содержащего 10 мМ HEPES pH 7,5 и 4 мМ MgCl2,<бр/> заметка: Чтобы ограничить потерю нуклеосом при низкой конечной концентрации, разведения следует проводить по одному, непосредственно перед осаждением на APS-слюду.
  4. Поместите 5-10 μL разведенного образца нуклеосом в центр кусочка APS-слюды и дайте ему инкубироваться в течение двух минут. Аккуратно промойте образец 2-3 мл dd H2O, чтобы удалить все компоненты буфера. После использования каждого ~0,5 мл dd H2O осторожно встряхните слюду, чтобы удалить излишки промывочной воды.
    заметка: Для этого этапа полоскания рекомендуется использовать одноразовый шприц.
  5. Высушите осажденный образец под легким потоком чистого газообразного аргона.
    заметка: Теперь образец готов к визуализации или может храниться в вакуумном шкафу или эксикаторе, заполненном аргоном. Образцы, подготовленные и хранящиеся в соответствии с описанием, были сфотографированы через год после подготовки без потери качества. Протокол можно поставить на паузу здесь.

3. Статическая АСМ визуализация нуклеосом

  1. Установите наконечник AFM на держатель наконечника. Используйте наконечник с пружинной постоянной ~40 Н/м и резонансной частотой от 300 до 340 кГц (см. Таблицу материалов для используемых здесь консолей).
  2. Устанавливайте изготовленный в разделе 3 образец на столик АСМ, стараясь не соприкасаться с поверхностью образца.
  3. Расположите лазер над консолью до тех пор, пока сумма не достигнет максимума, и отрегулируйте значения вертикального и бокового отклонения почти до нуля.
  4. Настройте зонд АСМ на определение его резонансной частоты и отрегулируйте амплитуду привода, а также установите размер изображения 100 x 100 нм. Нажмите кнопку «Включить», чтобы начать подход.
  5. После приближения постепенно оптимизируйте заданное значение амплитуды до тех пор, пока поверхность образца не станет четко видна. Увеличьте размер сканирования до 1 x 1 μm и разрешение до 512 x 512 пикселей. Нажмите кнопку захвата, а затем кнопку вовлечения, чтобы начать получение изображения.
    заметка: Изображения на рисунке 2 показывают гладкий фон, который можно ожидать при визуализации этих образцов.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

figure-results-1
Рисунок 1: Схема процесса получения функционализованной АФС слюды для АСМ визуализации нуклеосом. (А) кусок слюды толщиной ~0,1 мм имеет обе стороны свежерасщепленными. (B) Расщепленный кусочек слюды немедленно помещают по диагонали в кювету, содержащую раствор APS, и устанавливают на инкубацию в течение 30 мин. (C) После этапа функционализации APS кусочек слюды APS переносят в кювету, наполненную dd H2O, для полоск...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
Конфликт интересов не декларируется.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
CENP-A/H4)2, рекомбинантный человекEpiCypher, Дарем, Северная Каролина16-0010Каталожный номер для 50 мкг
H2A/H2B, рекомбинантный человекEpiCypher, Дарем, Северная Каролина15-0311Каталожный номер для 50 мкг
H3 Октамер, рекомбинантный человекEpiCypher, Дарем, Северная Каролина16-0001 (АнглийскийКаталожный номер для 50 мкг
Комплект диализных аппаратов Slide-A-Lyzer MINI, 10K MWCO, 0,1 млThermoFischer Scientific, Уолтем, МассачусетсNo 69574Каталожный номер на 10 устройств
Хлорид натрияСигма-Олдрич, Сент-Луис, МиссуриС9888-500ГКаталожный номер для 500 мг
Центробежные фильтры Amicon Ultra-0,5 млMillipore-sigma, Берлингтон, МиссуриUFC501008Каталожный номер на 8 устройств
список совместимого оборудованияСигма-Олдрич, Сент-Луис, Миссури258148-25МЛКаталожный номер для 25 мл
ТрицинСигма-Олдрич, Сент-Луис, МиссуриТ0377-25ГКаталожный номер для 25 г
Паспорт безопасностиСигма-Олдрич, Сент-Луис, Миссури11667289001Каталожный номер за 1 кг
Персульфат аммония (AmmPS)Bio-Rad, Геркулес, Калифорния1610700 (АнглийскийКаталожный номер для 10 г
30% раствор акриламида/биса, 37,5:1Bio-Rad, Геркулес, Калифорния1610158Каталожный номер для 500 мл
ТЕМЕДBio-Rad, Геркулес, Калифорния1610800 (АнглийскийКаталожный номер для 5 мл
4x Буфер для образцов белка Laemmli для SDS-PAGEBio-Rad, Геркулес, Калифорния1610747Каталожный номер для 10 мл
2-МЕСигма-Олдрич, Сент-Луис, МиссуриМ6250-10МЛКаталожный номер для 10 мл
ageRuler Предварительно окрашенный протеиновый лестникThermoFischer Scientific, Уолтем, МассачусетсNo 26616Каталожный номер для 500 мкл
Биобезопасное™ пятно для кумассиBio-Rad, Геркулес, Калифорния1610786Каталожный номер на 1 л
Нетканые салфетки для чистых помещений: TX604 TechniClothTexWipe, Кернерсвиль, Северная КаролинаТХ604
Слюда из блока МосковитAshevilleMica, Ньюпорт-Ньюс, ВирджинияКласс-1
ХЕПЕССигма-Олдрич, Сент-Луис, МиссуриН4034-25ГКаталожный номер для 25 г
СкотчScotch-3M, Сент-Пол, Миннесота
Асм-зонд TESPA-V2 (для статической визуализации)Зонды Bruker AFM, Камарильо, Калифорния
Фильтр Millex-GP, 0,22 мкмСигма-Олдрич, Сент-Луис, МиссуриSLGP05010Каталожный номер на 10 устройств
Щуп BL-AC10DS-A2 AFM (для HS-AFM)Олимп, Япония
Многорежимный атомно-силовой микроскопBruker-Nano/Veeco, Санта-Барбара, Калифорния
) ) )

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Atomic Force MicroscopyNucleosome VisualizationMica Surface FunctionalizationAPS Solution PreparationNucleosome DepositionContact Mode ImagingTopographic Image GenerationAFM Probe AlignmentElectrostatic BindingNucleosome Structure Analysis

Related Articles