Методическая статья

Высокоскоростная покадровая атомно-силовая микроскопия для захвата динамики нуклеосом

8 июля 2025 г.

В этой статье

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Источник: Stumme-Diers, M. P., et al., Исследование структуры и динамики нуклеосом с помощью атомно-силовой микроскопии.J. Vis. Exp.(2019)

В этом видео мы демонстрируем высокоскоростную покадровую атомно-силовую микроскопию, АСМ, методы визуализации для изучения динамики нуклеосомных комплексов. Когда наконечник АСМ сканирует поверхность нуклеосомы, он обнаруживает изменения в высоте нуклеосом и записывает раскрытие ДНК с течением времени.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Сборка мононуклеосом непрерывного разведения

  1. Получить и очистить субстрат ДНК массой около 400.о., содержащий смещенную от центра последовательность нуклеосом Widom 601.
    заметка: Чтобы ограничить нежелательное образование динуклеосом, каждое «плечо», фланкирующее позиционирующую последовательность, не должно превышать ~150.о.
    1. Используйте плазмиду pGEM3Z-601 вместе с разработанными праймерами и амплифицируйте ДНК субстрата с помощью ПЦР. Для используемого здесь субстрата 423.о. с длиной плеча 122 и 154.о. используйте прямой (5'-CAGTGAATTAATACGACTC-3') и обратный (5'-ACAGCTATGACCATGATTAC-3') праймеры.
    2. Добавьте пробирки, содержащие реакционную смесь, в термоамплификатор, предварительно нагретый до 95 °C. Запустите следующую программу в течение 33 циклов после начальной денатурации в течение 5 мин при 95 °C: 30 с денатурации при 95 °C, 30 с отжига при 49 °C и 35 с удлинения при 72 °C. Установите окончательное удлинение при 72 °C в течение 10 мин после 33 циклов.
    3. Очистите ДНК от ПЦР-смеси с помощью имеющегося в продаже набора для очистки ПЦР. При элюировании ДНК из колонки для очистки ПЦР используйте 10 мМ Трис-буфер (pH 7,5) вместо предоставленного набором элюирующего буфера.
      заметка: Будьте особенно осторожны, чтобы не переносить буферы между этапами очистки. Загрязненный элюент может вызвать проблемы при измерении концентрации ДНК и/или может изменить начальную концентрацию соли в смеси нуклеосомной сборки.
  2. Определите концентрацию ДНК путем измерения абсорбции очищенной ДНК при длине волны 260 нм.
    1. Соберите заготовку на УФ-ВИД спектрофотометре, используя только 10 мМ элюирующий буфер Tris pH 7,5. Соберите мерку очищенной ДНК.
  3. Определив концентрацию, добавьте 25 пмоль очищенной ДНК в микропробирку объемом 0,6 мл и поместите ее в вакуумную центрифугу до тех пор, пока раствор не станет едва видимым; обычно это составляет от 30 мин до 1 ч<бр/> заметка: Теперь субстрат ДНК готов к сборке нуклеосом. В противном случае протокол может быть приостановлен здесь, а ДНК храниться при температуре -20 °C до использования.
  4. Поместите микрофугальную пробирку, содержащую 25 пмоль ДНК, на лед и добавьте компоненты сборки нуклеосом, указанные в таблице 1, в указанном порядке. Когда все компоненты будут добавлены, снимите смесь со льда и инкубируйте при комнатной температуре (RT) в течение 30 мин.
    заметка: Крайне важно, чтобы содержание соли в буфере из стоковых гистонов учитывалось при расчете NaCl, необходимого для достижения конечной концентрации 2 М.
  5. Соберите нуклеосомы, уменьшив концентрацию соли на 2 М в смеси до 200 мМ с помощью непрерывного разбавления.
    1. Наполните шприц 100 μл разбавляющего буфера, содержащего 10 мМ Трис pH 7,5, и поместите его на шприцевой насос.
    2. Направьте иглу шприца через предварительно проколотое отверстие в колпачке микрофуг-пробирки, обеспечивая контакт со сборочной смесью (рис. 1).
    3. Запустите шприцевой насос со скоростью 0,75 μл/мин в течение 120 мин.<бр/> заметка: Полученный раствор объемом 100 мкл содержит 250 нМ нуклеосом и 200 мМ NaCl.
    4. Переложите смесь на диализную кнопку MWCO 10 K и диализуйте против 200 мл предварительно охлажденного (4 °C) буфера с низким содержанием солей, содержащего 10 мМ Tris pH 7,5, 0,25 мМ EDTA и 2,5 мМ NaCl, в течение 1 часа при 4 °C.
  6. Чтобы оценить содержание гистонов в сборке нуклеосом, приготовьте прерывистый гель SDS-PAGE с 15% разделения и 6% укладки, как описано ранее.
    1. Добавьте 10 - 20 μл нуклеосомного запаса в микрофугальную пробирку и добавьте 4x Laemmli Sample Buffer до рабочей концентрации 1 - 2x.
    2. В качестве контроля повторите этот препарат в отдельной микрофуге для 1 - 2 мкг гистонового запаса. Нагрейте образцы до 95 °C в течение ~ 5 минут.
    3. Загрузите образцы в соседние полосы друг к другу на гель. Добавьте буфер сэмплов к неиспользуемым полосам, чтобы обеспечить равномерную миграцию полос
      4. .
    4. Запускайте гель при напряжении 65 В до тех пор, пока фронт красителя не пройдет через стекируемый гель. Когда разделительный гель будет достигнут, увеличьте его до 150 В и продолжайте до тех пор, пока фронт красителя полностью не выйдет из геля.
    5. Демонтируйте блок электрофореза и аккуратно переложите гель в емкость для окрашивания, наполненную dd H2O. Оставьте гель на 5 минут, слегка взбалтывая. Повторите этот процесс еще дважды, используя каждый раз свежий dd H2O.
      заметка: Морилка Кумасси, используемая в этом протоколе, не требует типичных этапов фиксации, необходимых для морилки Кумасси (см. Таблицу материалов). Если используется другой препарат Кумасси, при необходимости скорректируйте шаги фиксации.
    6. Удалите воду из последнего полоскания и добавьте ровно столько пятна, чтобы покрыть гель. Дайте гелю настояться при легком перемешивании не менее 1 ч.<бр/> заметка: Для перемешивания емкость для окрашивания может быть размещена на любом устройстве, которое способствует движению пятна по гелю, а также сохраняет гель покрытым жидкостью.
    7. Удалите пятно из контейнера и смойте гель с помощью dd H2O. Замените dd H2O и замочите гель на 30 минут с легким помешиванием. (Гель должен выглядеть так, как показано на рисунке 2, с четким разделением полос гистонов.)
  7. Храните нуклеосомы при температуре 4 °C до использования.
    заметка: При хранении в этих условиях нуклеосомы остаются стабильными в течение нескольких месяцев. Протокол можно поставить на паузу здесь.

2. Высокоскоростная покадровая АСМ визуализация динамики нуклеосом

ПРИМЕЧАНИЕ: Приведенный ниже протокол предоставлен для инструмента HS-AFM, разработанного группой Ando (Университет Канадзава, Канадзава, Япония).

  1. Подготовьте APS-слюду для жидкостной визуализации.
    1. Прикрепите стеклянный стержень к столику сканера АСМ с помощью клея стеклостержень-сканер (см. Таблицу материалов). Дайте ему высохнуть не менее 10 минут.
    2. Сделайте круглые кусочки слюды толщиной ~0,1 мм и диаметром 1,5 мм, пробивая их из большего листа слюды. С помощью клея HS-AFM для слюдяного стержня (см. Таблицу материалов) прикрепите этот кусочек слюды к стеклянному стержню на HS-AFM и высушите нетронутым в течение как минимум 10 минут. Разбивайте слои с помощью чувствительной к давлению ленты до тех пор, пока на ленте не будет виден хорошо расщепленный слой.
    3. Разбавьте 1 мкл 50 мМ АФС в 99 мкл dd H2O до получения 500 мкМ раствора АФС. Нанесите 2,5 μл этого раствора на свежерасщепленную поверхность слюды и дайте функционализироваться в течение 30 мин. <бр/> заметка: Чтобы предотвратить высыхание поверхности во время функционализации, на крышку конической центрифужной пробирки объемом 50 мл можно надеть влажный кусок фильтровальной бумаги и поместить ее над сканером. Для жидкостной визуализации масса APS разбавляется в 3 раза меньше, чем для статической визуализации, чтобы контролировать динамику до скорости, которая может наблюдаться с помощью АСМ.
    4. Промойте слюду 20 μL dd H2O, нанеся несколько полосканий ~3 μL. Полностью удаляйте воду после каждого полоскания, положив нетканую салфетку на край слюды. После окончательного промывки нанесите ~3 μL dd H2O на поверхность и оставьте минимум на 5 минут, чтобы удалить все неспецифически связанные APS.
  2. Поместите щуп в держатель HS-AFM и расположите держатель на столике AFM наконечником вверх. Промойте держатель с помощью ~100 μL dd H2O, а затем два промывания ~100 μL фильтрованным буфером для визуализации нуклеосом размером 0,22 μм, который содержит 10 мМ HEPES pH 7,5 и 4 мМ MgCl2.
  3. После промывки заполните камеру ~100 μL буфера для визуализации нуклеосом, погрузив наконечник в воду. Отрегулируйте положение кантилевера до тех пор, пока в него не попадет лазер. Промойте APS-слюду 20 мкл отфильтрованного буфера для визуализации нуклеосом, используя ~4 мкл на промывку.
  4. Разбавьте 1 мкл нуклеосомного сборочного материала в 250 мкл отфильтрованного буфера для визуализации нуклеосом до конечной концентрации нуклеосом 1 нМ. Нанесите 2,5 мкл этого разбавления на поверхность и оставьте на 2 минуты. Промойте поверхность ~ 4 мкл буфера для визуализации нуклеосом два раза. После окончательного промывки оставьте поверхность покрытой буфером для визуализации.
    заметка: Если поверхность не промыть после осаждения образца нуклеосомы, поверхность быстро станет переполненной.
  5. Установите сканер и образец на верхнюю часть держателя наконечника так, чтобы образец лежал лицевой стороной вниз. Чтобы начать заход на посадку, используйте функцию автоматического сближения с амплитудой заданного значения As, близкой к амплитуде свободных колебаний A0.
    заметка: В идеале As = 0,95 A0, однако работа на 82% от A0 также будет работать, если быть осторожным.
  6. Регулируйте заданное значение до тех пор, пока поверхность не будет хорошо отслеживаться.
    заметка: Чтобы свести к минимуму передачу энергии от кончика АСМ к образцу нуклеосомы, амплитуда кантилевера должна быть небольшой, с оптимальной амплитудой до 1 нм.
  7. Установите область изображения в диапазоне от 150 x 150 нм до 200 x 200 нм со скоростью сбора данных ~300 мс на кадр изображения.
    заметка: Такого размера изображения обычно достаточно для одновременного захвата динамики нескольких нуклеосом. Менее заполненная поверхность может потребовать изменения этих параметров. Рекомендуемая частота кадров достаточна для захвата нуклеосомной динамики, такой как зацикливание, скольжение и развертка, среди прочего (см. раздел «Репрезентативные результаты» ниже).

Таблица 1: Реагенты, необходимые для непрерывной сборки нуклеосом с градиентом соли. Каждый из перечисленных компонентов добавляется в микропробирку, содержащую очищенную ДНК. Это следует делать в том порядке, в котором реагенты перечислены в таблице, при этом сначала добавляются вода и NaCl, а затем димер H2A/H2B и тетрамер гистона. Если вы хотите использовать предварительно сложенные октамеры гистонов, добавьте их в том же соотношении, что и для тетрамера, указанного выше. * Обратите внимание на содержание NaCl в каждой из запасов гистонов и отрегулируйте 5M NaCl, чтобы добавить соответственно, итоговый [NaCl] должен быть равен 2M. (см. Таблицу материалов).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

figure-results-1
Рисунок 1: Схема шприцевого насоса, используемого для микромасштабной сборки нуклеосом.Сборочная смесь располагается таким образом, чтобы она соприкасалась с концом иглы шприца. По мере того, как буфер для разбавления подается шприцевым насосом в сборочную смесь, концентрация NaCl снижается, способствуя сборке нуклеосом. Этот рисунок адаптирован из Stumme-Diers et al.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
Конфликт интересов не декларируется.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Плазмида pGEM3Z-601Addgene, Кембридж, МассачусетсNo 26656
Праймеры для ПЦРIDT, Коралвилль, АйоваИндивидуальный заказ(FP) 5'- CAGTGAATTGTAATACGACTC-3'
(RP) 5'-ACAGCTATGACCATGATTAC-3'
Полимераза DreamTaqThermoFischer Scientific, Уолтем, МассачусетсЭП0701Каталожный номер на 200 единиц
Набор для очистки ПЦРQiagen, Хильден, Германия No 28104Каталожный номер на 50 единиц
База TrisСигма-Олдрич, Сент-Луис, Миссури10708976001Каталожный номер для 250 г
ЭдтаThermoFischer Scientific, Уолтем, Массачусетс15576028Каталожный номер для 500 г
(CENP-A/H4)2, рекомбинантный человекEpiCypher, Дарем, Северная Каролина16-0010Каталожный номер для 50 мкг
H2A/H2B, рекомбинантный человекEpiCypher, Дарем, Северная Каролина15-0311Каталожный номер для 50 мкг
H3 Октамер, рекомбинантный человекEpiCypher, Дарем, Северная Каролина16-0001 (АнглийскийКаталожный номер для 50 мкг
Комплект диализных аппаратов Slide-A-Lyzer MINI, 10K MWCO, 0,1 млThermoFischer Scientific, Уолтем, МассачусетсNo 69574Каталожный номер на 10 устройств
Хлорид натрияСигма-Олдрич, Сент-Луис, МиссуриС9888-500ГКаталожный номер для 500 мг
Центробежные фильтры Amicon Ultra-0,5 мл Millipore-sigma, Берлингтон, МиссуриUFC501008Каталожный номер на 8 устройств
список совместимого оборудованияСигма-Олдрич, Сент-Луис, Миссури258148-25МЛКаталожный номер для 25 мл
ТрицинСигма-Олдрич, Сент-Луис, МиссуриТ0377-25ГКаталожный номер для 25 г
Паспорт безопасностиСигма-Олдрич, Сент-Луис, Миссури11667289001Каталожный номер за 1 кг
Персульфат аммония (AmmPS) Bio-Rad, Геркулес, Калифорния1610700 (АнглийскийКаталожный номер для 10 г
30% раствор акриламида/биса, 37,5:1Bio-Rad, Геркулес, Калифорния1610158Каталожный номер для 500 мл
ТЕМЕДBio-Rad, Геркулес, Калифорния1610800 (АнглийскийКаталожный номер для 5 мл
4x Буфер для образцов белка Laemmli для SDS-PAGEBio-Rad, Геркулес, Калифорния1610747Каталожный номер для 10 мл
2-МЕСигма-Олдрич, Сент-Луис, МиссуриМ6250-10МЛКаталожный номер для 10 мл
PageRuler Предварительно окрашенный протеиновый лестник ThermoFischer Scientific, Уолтем, МассачусетсNo 26616Каталожный номер для 500 мкл
Биобезопасное™ пятно для кумассиBio-Rad, Геркулес, Калифорния1610786Каталожный номер на 1 л
Нетканые салфетки для чистых помещений: TX604 TechniCloth TexWipe, Кернерсвиль, Северная КаролинаТХ604
Слюда из блока МосковитAshevilleMica, Ньюпорт-Ньюс, ВирджинияКласс-1
Аминопропилсилатран (АПС)Синтезировано, как описано в пункте 22
ХЕПЕССигма-Олдрич, Сент-Луис, МиссуриН4034-25ГКаталожный номер для 25 г
СкотчScotch-3M, Сент-Пол, Миннесота
Арон Альфа Промышленный клей КрейзиToagosei America, Западный Джефферсон, ОгайоАА480Каталожный номер для тубы 2 г
MgCl2Сигма-Олдрич, Сент-Луис, МиссуриМ8266-100ГКаталожный номер для 100 г
Фильтр Millex-GP, 0,22 мкмСигма-Олдрич, Сент-Луис, МиссуриSLGP05010Каталожный номер на 10 устройств
Щуп BL-AC10DS-A2 AFM (для HS-AFM)Олимп, Япония
Компаунд FG-3020C-20 FluoroTechnology Co., Ltd., Кагия, Касугай, Айти, Япония
Компаунд ФС-1010С135-0,5 FluoroTechnology Co., Ltd., Кагия, Касугай, Айти, Япония
Высокоскоростная покадровая атомно-силовая микроскопияТосио Андо, Институт нанонаук о жизни, Университет Канадзава, Какума-мати, Канадзава, Япония
) ) )

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи