$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Все процедуры с участием людей были выполнены в соответствии с институциональными, национальными и международными рекомендациями по благополучию человека и были проверены местным институциональным наблюдательным советом
1. Первичная фиксация, постфиксация, встраивание, секционирование и контрастирование
- Приготовьте 1,6 мл первичного фиксирующего раствора (2,5% глутаральдегида в 0,1 М буфере из какодилата натрия (pH 7,3)) в микроцентрифугирующей пробирке объемом 2 мл. Хранить при температуре 5 °C не более 14 дней.
- Из биопсии мышцы или всей мышцы выделите небольшой образец, который имеет максимальный диаметр 1 мм в любом направлении и немного длиннее в продольном направлении волокон, чем в поперечном сечении (для ориентации).
- Поместите образец в пробирку с холодным раствором для первичной фиксации. Хранить при температуре 5 °C в течение 24 часов.
- Промойте образец четыре раза (15 мин между каждым промывкой) в 0,1 М буфере из какодилата натрия (pH 7,3). С помощью пипеток для переноса удалите использованный буфер из пробирки, оставив образец нетронутым, а затем добавьте свежий буфер.
заметка: После окончательной промывки образец можно хранить в буфере из какодилата натрия 0,1 М при температуре 5 °C в течение нескольких месяцев. Протокол можно поставить на паузу здесь.
- Постфикс с 1% тетраоксидом осмия (OsO4) и 1,5% ферроцианидом калия (K4Fe(CN)6) в 0,1 М буфере какодилата натрия (pH 7,3) в течение 120 мин при 4 °C.
заметка: Использование 1,5% ферроцианида калия (K4Fe(CN)6) имеет важное значение для оптимального контраста частиц гликогена.
- Дважды промойте в дважды дистиллированной воде при комнатной температуре (RT).
- Обезвоживание путем погружения в дифференцированный ряд спирта (этанола) в режиме RT с использованием следующих концентраций: 70% (10 мин), 70% (10 мин), 95% (10 мин), 100% (10 мин><) и 100% (10 мин).
заметка: На каждом этапе образец погружают в этанол, который затем удаляют лишь частично, чтобы избежать высыхания образца. Наконец, оставшийся этанол выбрасывается.
- Инфильтрат градуированными смесями окиси пропилена и эпоссидовой смолы в РТ с использованием следующих объемных соотношений (оксид пропилена/эпоссидовая смола): 1/0 (10 мин), 1/0 (10 мин), 3/1 (45 мин), 1/1 (45 мин), 1/3 (45 мин), 0/1 (ночь). На следующий день образцы погружают в формы из 100% свежей эпоссидовой смолы и полимеризуют при 60 °C в течение 48 часов.
- Отрежьте ультратонкие (60-70 нм) участки продольно ориентированных волокон и соберите их на медные сетки с одним отверстием следующим образом.
- Установите блок образца на держатель ультрамикротома.
- Обрежьте блок на поверхности лезвием бритвы для того, чтобы достичь уровня ткани.
- Установите алмазный нож (ultra cut 45) перед образцом и выровняйте поверхность образца параллельно ножу.
- Изготовьте полутонкий (1 мкм) срез с помощью алмазного ножа, чтобы проверить ориентацию образца. Окрасьте полутонкий срез толуидиновым синим для наблюдения с помощью световой микроскопии.
- Обрежьте блок еще больше, чтобы уменьшить область интереса, чтобы получить правильные ультратонкие срезы.
- Вырежьте ультратонкие (60-70 нм) участки вторым алмазным ножом (ultra cut 45).
- Соберите 1-2 секции на медных сетках с одним отверстием с помощью Perfect Loop.
заметка: Медная сетка с одним отверстием имеет одно отверстие посередине с опорной мембраной Formvar.
- Сравните срезы с уранилацетатом и цитратом свинца, погрузив вышеуказанные сетки в раствор уранилацетата (0,5% в воде двойной дистилляции) на 20 мин, а затем в раствор цитрата свинца (1% в воде двойной дистилляции) на 15 мин. Промойте решетки в воде двойной дистилляции между двумя пятнами и после них.<бр/>
заметка: Протокол можно поставить на паузу здесь.
2. Визуализация
- Включите просвечивающий электронный микроскоп (работает при ускоряющем напряжении 80 кВ), компьютер и программное обеспечение для записи изображений. Записывайте цифровые изображения с помощью цифровой ПЗС-камеры с замедленным сканированием 2 x 2 k и соответствующего программного обеспечения для обработки изображений.
- Вставьте сетку с несколькими срезами в предметный столик для микроскопа.
- Сначала просейте сетку при малом увеличении (например, x100), чтобы определить качество секций (т. е. отверстий в несущей мембране, мусора и т. д.) и выбрать секции наилучшего качества. При малом увеличении определяют направление мышечных волокон.
- Затем увеличьте увеличение с помощью луча, центрированного на периферийном волокне в сечении. Сфокусируйте изображение при увеличении выше 30 k, чтобы обеспечить достаточное количество мелких деталей на изображении, руководствуясь быстрым преобразованием Фурье в реальном времени, если оно доступно. Наконец, запишите изображения со временем экспозиции 1 с желаемым увеличением.
- Получите в общей сложности 24 изображения случайно выбранного волокна, т.е. 12 изображений миофибриллярного пространства и 12 изображений субсарколеммального пространства, при увеличении от 10 k до 40 k. Убедитесь, что изображения распределены по длине и ширине волокна в рандомизированном, но систематическом порядке для получения несмещенных результатов (рис. 1A).
заметка: Оптимальное увеличение зависит от доступного разрешения камеры и размера микрофотографий. Цель состоит в том, чтобы достичь окончательного разрешения, при котором диаметры частиц гликогена могут быть измерены с шагом в 1 нм, и включить общую площадь миофибриллярной области не менее 70мкм2 и общую длину волокна не менее 25 мкм, распределенную на 12 изображений миофибриллярного пространства и 12 изображений субсарколеммального пространства на каждое волокно. соответственно. 24 изображения на каждое волокно, скорее всего, дадут точность (коэффициент погрешности) объемного содержания различных пулов гликогена в диапазоне от 0,1 до 0,2 в отдельных волокнах скелетных мышц человека, крысы и мышей (рисунок 2E).
- Повторяйте шаги 2.4 и 2.5 до тех пор, пока не будет получено 6-10 волокон. При необходимости вырежьте дополнительные участки (с расстоянием не менее 150 мкм, чтобы избежать перекрытия уже нанесенных волокон) и повторите шаги 1.9-2.5.
3. Анализ изображений
- Импортируйте изображения в ImageJ, нажав «Файл» > «Открыть».
- Установите глобальный масштаб в соответствии с исходным размером изображения, нажав «Анализ» > «Установить масштаб».
- Увеличьте масштаб на 100%, нажав на «Изображение» > «Увеличить >
».
- Измерьте толщину одного Z-диска на изображение миофибриллярного пространства (12 на волокно) с помощью инструмента «Прямая линия» в меню «Инструменты» (рис. 1D). Рассчитайте среднюю толщину Z-диска каждого из 6-10 волокон.
- Определите 2-3 волокна с самым толстым средним Z-диском как волокна типа 1 как волокна типа 1 и 2-3 волокна с самым тонким средним Z-диском как волокна типа 2. Не обращайте внимания на промежуточные 2-4 волокна для дальнейшего анализа (рис. 1E).
ПРИМЕЧАНИЕ: Следующие шаги повторяются для каждого из 4-6 волокон образца. Объемные доли гликогена оцениваются методом точечного подсчета. Размер сеток выбирается таким образом, чтобы получить удовлетворительную высокую точность оценок. Это часто достигается путем достижения 250 ударов, которые затем диктуют общее количество необходимых очков и, в свою очередь, площадь на очко.
- С помощью инструмента Сегментированная линия (Segmented Line) измерьте длину самой внешней миофибриллы, видимой чуть ниже субсарколеммальной области (Рисунок 2A).
заметка: Эта длина используется для экспрессии субсарколеммального гликогена на площадь поверхности (т.е. длина самого внешнего миофибрилла, умноженная на толщину среза (60 нм); см. шаг 4.5). Следовательно, в анализ включается только субсарколеммальная область, которая представлена этой длиной.
- Вставьте сетку, нажав на Analyze > Tools > Grid, и установите Area Per Point на 32 400 нм2. Подсчитайте количество попаданий в пределах доступной длины на 12 субсарколеммальных изображениях, где крестик попадает на субсарколеммальный гликоген (рис. 2A). Попадание определяется как частица гликогена, присутствующая в правом верхнем углу креста.
- Вставьте сетку, нажав «Анализ > Инструменты > Сетка», и установите «Площадь на точку» на 160 000 нм2. Подсчитайте количество попаданий на 12 миофибриллярных изображениях, где крестик попадает во внутримиофибриллярное пространство (рис. 2B).
- Вставьте сетку, нажав на «Анализ > Инструменты > Сетка», и установите Площадь на точку на 3 600 нм2. Подсчитайте количество попаданий на 12 миофибриллярных изображениях, где крестик попадает на интрамиофибриллярный гликоген (рис. 2C).
- Вставьте сетку, нажав на Analyze > Tools > Grid, и установите Area Per Point на 32 400 nm2. Подсчитайте количество попаданий на 12 миофибриллярных изображениях, где крестик попадает на интермиофибриллярный гликоген (рис. 2D).
- С помощью инструмента «Прямая линия» измерьте диаметр пяти случайно выбранных частиц гликогена каждого бассейна для каждого из 12 изображений, чтобы получить в среднем 60 частиц на бассейн на одно волокно><.
ПРИМЕЧАНИЕ: В среднем 60 частиц в основном покрывают вариации внутри волокна (Рисунок 2F).
