1. Клеточная линия и клеточная культура
- Выращивайте RAW 264,7 макрофагов в модифицированной среде Dulbecco Eagle Medium (DMEM) с добавлением 10% (об/об.) термоинактивированной фетальной сыворотки крупного рогатого скота (FBS), 100 МЕ/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина в увлажненном инкубаторе при 37 °C и 5%CO2. Заменяйте питательные среды через день.
- Когда клетки станут сливаться на 80%, промойте пластину два раза, используя стерильный PBS.
- Отделите клетки, добавив 1000 мкл 0,5% трипсина-ЭДТА, и инкубируйте планшет для культивирования клеток в течение 3-5 минут в увлажненном инкубаторе при 37 °C.
- Рассмотрите планшет под световым микроскопом, чтобы подтвердить диссоциацию клеток. Добавьте 10 мл питательной среды, содержащей 10% FBS, для инактивации трипсина.
- Соберите клеточную суспензию в коническую пробирку объемом 50 мл и центрифугируйте при давлении 400 x g в течение 5 минут при комнатной температуре. Аккуратно ресуспендируйте клетки в полной среде для культивирования клеток и определите количество и жизнеспособность клеток с помощью окрашивания Trypan Blue (0,4%).
заметка: Рекомендуемая минимальная жизнеспособность клеток для этого эксперимента составляет >90%.
- Поместите стерильные стеклянные покровные стекла в лунки 24-луночного планшета с помощью автоклавных щипцов. Высевают клетки на покровные стекла при плотности 1 х 106 клеток/мл и инкубируют планшет в течение ночи в увлажненном инкубаторе при 37 °C и 5%CO2.
- Перед обработкой замените среду в каждой лунке свежей готовой средой объемом 500 мкл. Предварительно обработайте макрофаги носителем (ДМСО или другими растворителями, используемыми для растворения EIPA) или ингибитором макропиноцитоза 5-(N-этил-N-изопропил)-амилоридом (EIPA, 25 мкМ) в течение 30 мин.
- Обрабатывают клетки носителем и стимуляторами макропиноцитоза для стимуляции взъерошивания мембран: форболом 12-миристат 13-ацетатом (PMA, 1 мкМ, 30 мин) и макрофагальным колониестимулирующим фактором (M-CSF, 100 нг/мл, 30 мин).
заметка: Альтернативные ингибиторы [например, латрункулин А (1 мкМ, 30 мин) или цитохалазин D (1 мкМ, 30 мин)] и стимуляторы [например, эпидермальный фактор роста (EGF, 100 нг/мл, 10 мин) или тромбоцитарный фактор роста (PDGF, 100 нг/мл, 15 мин)] макропиноцитоза также могут быть использованы для характеристики макропиноцитоза в макрофагах и других типах клеток. Клеткам может потребоваться ночное сывороточное голодание перед лечением физиологическими стимуляторами макропиноцитоза. Важно отметить, что для стимуляции макропиноцитоза в других типах клеток необходимо определить наиболее эффективные концентрации и время инкубации.
2. Фиксация SEM
- После обработки отсасывайте среду из лунок и дважды промойте покровные стекла ледяным PBS.
- Фиксируют клетки (4% параформальдегида и 2% глутаральдегида в 0,1 М какодилате натрия) в течение 30 мин при комнатной температуре, с последующей ночной инкубацией в фиксаторе при 4 °С.
- Аккуратно промойте и инкубируйте покровные стекла с 500 μл следующих реагентов, не нарушая монослой клеток.
- Промойте один раз в 0,1 М какодилата натрия и выдержите 15 минут.
- Дважды промыть с dH2O с 10-минутной инкубацией в каждой стирке.
- Дважды промыть 25% этанолом с 10-минутной инкубацией в каждой стирке.
- Дважды промыть 50% этанолом с 10-минутной инкубацией при каждой стирке.
- Дважды промыть с 75% этанолом с 10-минутной инкубацией при каждой стирке.
- Дважды промыть с 80% этанолом с 10-минутной инкубацией при каждой стирке.
- Дважды промыть с 95% этанолом с 10-минутной инкубацией при каждой стирке.
- Дважды постирать со 100% этанолом. Выполняйте 10-минутную инкубацию при каждой промывке.
заметка: Замена/замена реагентов должна производиться быстро, чтобы предотвратить высыхание клеток на воздухе. Покровные стекла можно оставить в 100% этаноле на несколько дней при температуре 4 °C. Для длительного хранения добавьте дополнительно 100% этанол и накройте лунки парапленкой, чтобы предотвратить высыхание образца на воздухе.
3. Сушка в критической точке
- Поместите покровные крышки в сушилку для критических точек и накройте их 100% этанолом. Нажмите кнопку питания и откройте бак CO2.
- Нажмите кнопку Cool и удерживайте ее в течение примерно 30 с, пока температура не снизится до 0 °C. Нажимайте кнопку Fill до тех пор, пока в окне камеры не появится пузырь.
- Нажимайте кнопку «Продувка» до тех пор, пока запах этанола из продувочного выхлопа не исчезнет. Нажмите кнопку Cool еще раз, пока температура не снизится до 0 °C.
- Нажмите кнопки Fill и Pun, чтобы выключить их и закрыть бак CO2. Нажмите кнопку Cool, чтобы выключить его, и нажмите кнопку Heat.
- Установите температуру 42 °C и давление 1 200 фунтов на квадратный дюйм. Как только давление и температура стабилизируются, нажмите кнопку «Сброс», чтобы давление медленно снижалось.
- Как только давление в камере достигнет 150 фунтов на квадратный дюйм, нажмите кнопку «Вентиляция» и подождите, пока давление не снизится до 0 фунтов на квадратный дюйм. Выключите сушилку для критических точек и снимите покровные стекла.
- Покровные стекла устанавливаются на крепления алюминиевых образцов SEM с использованием углеродных клеевых вкладок и с нанесением покрытия методом напыления с использованием золота/палладия в машине для нанесения покрытий методом напыления.
- Включите кнопку питания и подождите, пока вакуум достигнет 30 мТорр. Промойте камеру, чтобы удалить влагу и воздух, выключив газовый выключатель и повернув клапан тонкого газа против часовой стрелки.
- Как только вакуум увеличится до 200 мТорр, выключите газовый выключатель и подождите, пока вакуум достигнет 30 мТорр. Повторите этот шаг 3 раза.
- Нажмите кнопку таймера и отрегулируйте ручку напряжения до тех пор, пока датчик не покажет 10 мА. Снимите покровные стекла с покрытием из камеры.
заметка: Следуйте инструкциям производителя для выполнения сушки в критических точках и нанесения покрытия на образец методом распыления.
4. Визуализация и количественная оценка
- Вставьте покровные стекла для образцов в камеру сканирующего электронного микроскопа. Закройте дверцу и нажмите кнопку «Эвакуироваться».
- Откройте программное обеспечение для управления SEM. Установите ускоряющее напряжение на 15 кВ и рабочее расстояние на 10 мм.
- Нажмите кнопку «Координаты» и перемещайтесь по контроллеру, пока ячейки не появятся в центре экрана наблюдения. Установите увеличение на 3,500x и сфотографируйте образец, нажав кнопку «Фото».
заметка: Используйте более высокий уровень увеличения (от 8 500x до 16 000x), чтобы показать плазматическую мембрану с большей детализацией.
