$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Все процедуры, связанные с животными, были проверены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом JoVE.
1. Предварительная расстановка животных
- Взвесьте мышь и загрузите соответствующий препарат (например, каннабиноид, 5 мг/кг массы тела (bw)) в инсулиновый шприц. Препарат вводят за 30 минут до индукции тромба.
- Удерживая горловину мыши между большим и указательным пальцами, а мизинцем и хвост мыши, вытяните животное и введите препарат внутрибрюшинно (ип) в левый нижний квадрант брюшной полости. Посадите животное обратно в клетку на 15 минут.
- Приготовьте анестезию кетамином (90 мг/кг веса тела) и ксилазином (25 мг/кг веса тела). За 15 минут до индукции тромба обезболите мышь. Посадите мышь в клетку, слегка потяните за хвост и введите анестетик ip с помощью инсулинового шприца.
- Поместите мышь обратно в клетку до начала анестезии. Чтобы убедиться в достаточной анестезии, защемите хвост щипцами.
- Загрузите 0,05 мл размороженного флуоресцеина изотиоцианат-меченого декстрана (ФИТК-декстран; 5%, 150 кДа) в инсулиновый шприц. При наполнении шприца следите за тем, чтобы не осталось пузырьков воздуха, потому что даже небольшие внутривенно вводимые пузырьки воздуха могут быть смертельными для животного.
- Поместите мышь под наркозом на нагревательную пластину в положении лицевой стороной вниз. Отрегулируйте нагревательную пластину на 37 °C.
- Нанесите глазную мазь на роговицу мыши. Дезинфицируйте кожу и используйте стерильные инструменты.
- Прострочите два шва из полипропилена 7/0 в краниальный и каудальный край правого уха. Расположите стежки как можно ближе к краю и как можно ближе к основанию (рисунок 1B).
- Переведите мышь в дорсальное положение. Закрепите все ножки к платформе из акрилового стекла с помощью клеевых полос. Зацепите шов за передние зубы и расположите головку в положении тыльного сгибания, приклеив шов к акриловому стеклу с помощью клеевых полосок.
- Переместите животное на платформу под операционный стереомикроскоп. Используйте 16-кратное увеличение.
2. Препарирование левой яремной вены и инъекция FITC-декстрана
Примечание: Для микроскопии правого уха подготовьте левую яремную вену.
- С помощью скальпеля сделайте 5-миллиметровый разрез на коже на левой стороне шеи в краниокаудальном направлении. Рассеките подкожную клетчатку с помощью микрощипцов и микроножниц. Либо лигать перекрещивающиеся сосуды с полиэфирными швами 8/0, либо с электрокоагуляцией.
- Освободите вену от ее адвентиции с помощью микрощипцов и микроножниц, не касаясь сосуда.
- Используйте подготовленный инсулиновый шприц для инъекции флуоресцентного красителя. Осторожно захватите стенку сосуда микрощипцами, не проделывая вену. Проникните шприцем в растянутую стенку сосуда и введите ФИТК-декстран внутривенно.
- Остановить кровотечение после извлечения шприца можно с помощью ватных палочек. Избегайте загрязнения уха кровью и красителем.
3. Позиционирование правого уха для прижизненной флуоресцентной микроскопии
- Перенесите животное на нагревательную пластину в конструкцию из акрилового стекла с прорезью для нагревательной пластины и плоскостью высотой 0,5 см для расположения уха.
- Закрепите животное лицевой стороной вниз на нагревательной пластине с помощью клеевых полосок. Поместите относительно прочный и выпуклый хрящ у основания уха рядом с плоскостями уха высотой 0,5 см (рис. 1B) так, чтобы апикальная часть уха могла быть расположена на плоскости.
- Добавьте одну каплю 0,9% NaCl комнатной температуры в плоскость акрилового стекла, чтобы расположить ухо. Поместите правое ухо с заранее наложенными швами на его вогнутой вентральной стороне, обращенной вниз, на каплю 0,9% NaCl. С помощью ватных палочек впитайте каплю NaCl и позвольте капиллярным силам прикрепить плоскость уха к акриловому стеклу.
- Прикрепите швы к акриловому стеклу, чтобы зафиксировать положение уха.
- Добавьте одну каплю NaCl комнатной температуры 0,9% на выпуклую тыльную сторону уха. Осторожно наложите на ухо одну покровную трубку (диаметром 0,5 см), не сдавливая входящие в ухо базальные сосуды. С помощью ватных палочек удалите как можно больше NaCl из-под покровного стекла, чтобы свести к минимуму расстояние между покровным стеклом и сосудами-мишенями для уха.
4. Прижизненная флуоресцентная микроскопия и индукция тромба правого уха
- Отрегулировать прижизненный флуоресцентный микроскоп для визуализации FITC-декстрана (450 - 490 нм; ФУТ: 510; LP: 520). В качестве источника света используйте ртутную лампу переменного тока мощностью 100 Вт. Подключите черно-белую ПЗС-камеру с высоким разрешением к DVD-рекордеру.
- Перенесите животное на акриловом стекле, содержащем нагревательную пластину с неподвижным отведенным ухом, к столу прижизненного флуоресцентного микроскопа.
- Используя 20-кратное увеличение (числовая апертура 20X/0,95) и 20% интенсивность света, найдите венозный сосуд диаметром 50 - 60 мкм и с антероградным кровотоком 400 - 600 мкм/с.
- Добавьте одну каплю воды комнатной температуры в покровное стекло для погружения в воду объектива с 63-кратным увеличением (63-кратная/0,95-кратная числовая апертура). С помощью шприца с канюлей диаметром 1 мм поместите каплю на объектив микроскопа. Добавьте ровно столько воды, чтобы она соприкасалась с покровным стеклом и объективом с каплей воды.
- Сразу после нанесения капли воды начните запись сосуда в течение 20 с с интенсивностью света 20% для измерения диаметра и кровотока в автономном режиме.
- Начните индукцию тромба через 5 минут после инъекции ФИТК-декстрана. Для этого увеличьте интенсивность света до 100%.
- Во время индукции тромба закройте отверстие микроскопа на 2 с в течение 30 с, чтобы проверить кровоток. В случае стойкого кровотока снова откройте отверстие. В случае остановки кровотока наблюдайте за сосудом в течение 30 с.<бр/>
заметка: Сосуд классифицируется как окклюзированный, если кровоток останавливается в течение 30 с или более или если кровь течет ретроградно. Если ортоградный кровоток возобновился, полностью откройте отверстие и продолжайте индукцию тромба до тех пор, пока не произойдет окклюзия сосуда, как описано выше. Во время ранней индукции тромба убедитесь, что время, когда отверстие было закрыто для проверки кровотока, было как можно короче, чтобы поддерживать почти непрерывное эпиосвещение. Позже, во время роста тромба, сосуд перфузируется менее флуоресцентным красителем, поэтому его можно наблюдать непрерывно.
- Выберите и окклюзируйте 5 сосудов на каждое ухо. Ограничьте время индукции тромба под микроскопом примерно до 1 ч после введения ФИТК-декстрана.
