$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Все процедуры с участием людей были выполнены в соответствии с институциональными, национальными и международными рекомендациями по благополучию человека и были рассмотрены местным институциональным наблюдательным советом.
1. Подготовка цитоспинов
- Получить два цитоспина с мононуклеарными клетками образцов пациента (т.е. один цитоспин для иммунофлуоресцентного окрашивания γH2AX и один цитоспин для комбинированного иммунофлуоресцентного окрашивания γH2AX и 53BP1) путем центрифугирования (300 x g, 10 мин) 1,0 x10 5 клеток для каждого препарата (рис. 1 и 2).
2. Иммунофлуоресцентное окрашивание γH2AX и 53BP1
- Фиксация и пермеабилизация: Зафиксируйте клетки 200 мкл 4% PFA на 10 минут. После фиксации аккуратно промойте клетки три раза 30 мл PBS в течение 5 минут каждая на лабораторном шейкере. Затем проникните в клетки 200 мкл 0,1% октоксинола 9 в течение 10 мин. Осторожно промойте клетки три раза 30 мл 5% блокирующего раствора в течение 5 минут на лабораторном шейкере. Заблокируйте клетки в 30 мл свежего 5% раствора для блокировки на 1 ч.
- Инкубация с антителами
- Инкубируют один препарат клеток с мышиным моноклональным антителом против γH2AX (1:500), а другой препарат клеток с мышиным моноклональным антителом против γH2AX (1:500) и поликлональным кроличьим антителом против 53BP1 (1:500) в течение ночи при 4 °C.
- После инкубации клетки осторожно промыть 3 раза 30 мл 2% блокирующего раствора в течение каждых 5 минут на лабораторном шейкере.
- Удалите блокирующий раствор и инкубируйте первый препарат клеток с конъюгированным с Alexa488 козьим вторичным антителом против мыши (1:500), а второй препарат клеток с конъюгированным с Alexa488 козьим вторичным антителом против мыши (1:500) и конъюгированным с Alexa555 ослиным вторичным антителом против кролика (1:500) в течение 1 ч при комнатной температуре.
- Монтажная среда: Поместите предметное стекло с клетками в миску и осторожно промойте клетки три раза 30 мл PBS в течение каждых 5 минут на лабораторном шейкере. Снимите PBS и установите на клетки монтажную среду, содержащую 4,6-диамидино-2-фенилиндол. Осторожно наденьте покровное стекло поверх монтажного носителя, чтобы в него не застряли пузырьки воздуха. Подождите не менее 3 ч для затвердевания монтажной среды, прежде чем анализировать клетки с помощью флуоресцентной микроскопии.
3. Анализ очагов γH2AX и 53BP1
- Флуоресцентная микроскопия: анализируйте очаги γH2AX и 53BP1 в ядрах клеток с помощью флуоресцентного микроскопа, оснащенного фильтрами для DAPI, Alexa 488 и Cy3 во время визуализации со 100-кратным увеличением объектива. Записывайте изображения с помощью камеры и обрабатывайте изображения с помощью соответствующего программного обеспечения для обработки изображений.
