Иммунофлуоресцентная микроскопия для анализа двухцепочечных разрывов ДНК

Аннотация

Источник: Popp, H. D., et al. Иммунофлуоресцентная микроскопия γH2AX и 53BP1 для анализа формирования и репарации двухцепочечных разрывов ДНК. J. Vis. Exp. (2017)

В этом видео мы описываем метод иммунофлуоресцентной микроскопии для обнаружения специфических белков ответа на повреждение ДНК, локализованных в местах двухцепочечных разрывов ДНК в мононуклеарных клетках человека. Белки распознаются специфическими первичными антителами, которые, в свою очередь, связываются с помеченными флуорофорами вторичными антителами, которые флуоресцируют во время микроскопической визуализации, что позволяет визуализировать белки в виде отдельных флуоресцентных очагов в ядрах клеток.

Протокол

Все процедуры с участием людей были выполнены в соответствии с институциональными, национальными и международными рекомендациями по благополучию человека и были рассмотрены местным институциональным наблюдательным советом.

1. Подготовка цитоспинов

1. Получить два цитоспина с мононуклеарными клетками образцов пациента (т.е. один цитоспин для иммунофлуоресцентного окрашивания γH2AX и один цитоспин для комбинированного иммунофлуоресцентного окрашивания γH2AX и 53BP1) путем центрифугирования (300 x g, 10 мин) 1,0 x^{10 5} клеток для каждого препарата (рис. 1 и 2

Результаты

Рисунок 1: Устройство для приготовления цитоспинов.

Рисунок 2: Подготовка цитоспинов. Два цитоспина каждого образца получают путем центрифугирования 1,0 х 10⁵ клеток при 300 х г в течение 10 мин. Один цитоспин используется для иммунофлуоресцентного окрашивания γH2AX, а другой цитоспин используется.......

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Предметные стекла диагностического микроскопа	Термо Сайентиал	ЭР-203Б-СЕ24	Предметные стекла для микроскопа
Мегафуга 1.0 Р	Герей	75003060	Настольная центрифуга
Аппарат Cytospin
крышка	Герей	76003422	Крышка для работы без микротрубок
Контейнер для цито	Герей	75003416	Контейнер Cyto с 2 коническими отверстиями
Держатель клипсы	Герей	75003414	Держатель для удержания контейнера с цито и предметного стекла
Опорная вставка	Герей	75003417	Опорная вставка для удержания держателя зажима
Параформальдегид	Сигма-Олдрич	П6148	Фиксирующий агент
Фосфатно-солевой буфер	Сигма-Олдрич	Д8537	Сбалансированный солевой раствор
Хемиблокатор	Мерк Миллипор	2170	Блокирующий агент
Мышиное моноклональное антитело к γH2AX (JBW301)	Мерк Миллипор	05-636	Первичное антитело для обнаружения γH2AX
Поликлональное антитело кролика к 53BP1 (NB100-304)	Компания Novus Biologicals	НБ100-304	Первичное антитело для выявления 53BP1
Alexa Fluor 488-конъюгированное антитело козы к мышам	Инвитроген	А-11001	Вторичные антитела
Alexa Fluor 555-конъюгированное антитело против кролика	Инвитроген	А-31572	Вторичные антитела
Монтажный носитель Vectashield	Лаборатория «Вектор	Н-1200	Содержит DAPI для окрашивания ДНК
Axio Scope.A1	Цейсс	490035	Флуоресцентный микроскоп
ПЗС-камера Cool Cube 1	Метасистемы	Х-0310-010-МС	Система камер для цифровой записи
Программное обеспечение Isis	Метасистемы	Не применимо	Программное обеспечение для микроскопа

г. »