$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Производство 15N, 13C-Tau (Рисунок 1)
- ATransform рекомбинантную экспрессию T7-плазмиды pET15b-Tau в BL21(DE3) компетентные бактериальные клетки Escherichia coli.
ПРИМЕЧАНИЕ: кДНК, кодирующая самую длинную (441 аминокислотный остаток) изоформу тау, клонируется между сайтами рестрикции NcoI и XhoI в плазмиде pET15b.
- Аккуратно смешайте 50 мл компетентных клеток BL21(DE3), образуя 1-5 x 107 колоний на мкг плазмидной ДНК, со 100 нг плазмидной ДНК в пластиковой пробирке объемом 1,5 мл><.
заметка: Оптимизированные для использования кодонов бактериальные штаммы для экспрессии эукариотической кДНК не являются существенными для производства человеческого тау.
- Поместите клеточную смесь на лед на 30 минут, а затем испытайте тепловой шок на 10 секунд при температуре 42 °C. Поместите трубку обратно на лед на 5 минут и добавьте 1 мл среды комнатной температуры LB (Лурия-Бертани). Инкубировать бактериальную суспензию при температуре 37 °C в течение 30 минут при слабом перемешивании.
- Равномерно распределите с помощью инокуляционной петли 100 мкл клеточной суспензии на агаровую пластину с ЛБ-средой, содержащей 100 мкг/мл антибиотика ампициллина.
- Инкубируйте отборочный планшет в течение 15 часов при температуре 37 °C.
- Держите отборочную пластину при температуре 4 °C до тех пор, пока не перейдете к этапу культивирования, максимум 2 недели.
ПРИМЕЧАНИЕ: глицериновый запас бактериальной культуры (50% глицерина), хранящийся при -80 °C, может быть приготовлен для начала культивирования на более поздней стадии.
- Добавьте 1 мл 1 М MgSO4, 1 мл 100 мМ CaCl2, 10 мл 100x MEM витаминной добавки, 1 мл 100 мг/мл ампициллина в 1 л автоклавированных солей M9 (6 г Na2HPO4, 3 г KH2PO4, 0,5 г NaCl).
заметка: При добавлении раствора CaCl2 к солям M9 образуется белый осадок, который быстро рассеивается.
- Растворите 300 мг 15N, 13С-полной среды, 1 г 15NH4Cl и 2 г 13С6-глюкозы в 10 мл среды М9. Отфильтруйте и стерилизуйте изотопный раствор с помощью фильтра 0,2 мкм непосредственно в среду M9.
- Суспензировать с помощью петли инокуляции одну колонию трансформированных бактерий pET15b-Tau из селекционного планшета в 20 мл среды LB с добавлением 100 мкг/мл ампициллина.
- Инкубируйте инокулированную среду при 37 °C в течение примерно 6 часов.
- Измерьте оптическую плотность при длине волны 600 нм (наружный диаметр600) на 1 мл десятикратного разведения бактериальной культуры в пластиковой кювете спектрометра.
заметка: Помутнение бактериальной культуры, соответствующее OD600 3,0-4,0, указывает на то, что достигнута фаза насыщенного роста.
- Добавьте 20 мл насыщенной культуры LB к 1 л питательной среды M9 с добавлением ампициллина (конечная концентрация 100 мкг/мл) в пластиковую колбу Эрленмейера для культуры с перегородкой.
- Поместите колбу с культурой в программируемый инкубатор, установленный на 10 °C и 50 об/мин. Запрограммируйте инкубатор на переключение на 200 об/мин и 37 °C рано утром следующего дня.
- Измерьте наружный диаметр600 на 1 мл бактериальной культуры в пластиковой кювете спектрометра. Добавьте 400 мкл 1 М раствора IPTG (изопропил-β-D-1-тиогалактопиранозид) (при температуре -20 °C), когда OD600 достигнет значения около 1,0, чтобы индуцировать экспрессию рекомбинантного тау-белка.
- Продолжайте инкубацию при 37 °C еще 3 часа. Соберите бактериальные клетки центрифугированием при температуре 5 000 x g в течение 20 минут.
- Заморозьте бактериальную гранулу при температуре -20 °C. Храните замороженной до этапа очистки, при необходимости в течение длительного времени.
2. Очистка 15N, 13C-Tau (Рисунок 2)
- Автоклавные катионообменные буферы (CEX) для очистки при 121 °C при давлении 15 фунтов на квадратный дюйм в течение 20 мин. Храните буферы при 4 °C.
- Разморозьте гранулу бактериальной клетки и тщательно суспендируйте в 45 мл экстракционного буфера CEX A (50 мМ буфер NaPi pH 6,5, 1 мМ ЭДТА) с добавлением коктейля ингибиторов протеазы 1x (1 таблетка) и DNAseI (2 000 единиц
).
- Разрушьте бактериальные клетки с помощью гомогенизатора высокого давления при давлении 20 000 фунтов на квадратный дюйм. Необходимо 3-4 прохода. Центрифугируйте при давлении 20 000 x g в течение 40 минут, чтобы удалить нерастворимый материал.
- Нагрейте экстракт бактериальной клетки в течение 15 минут при температуре 75 °C на водяной бане.
ПРИМЕЧАНИЕ: белый осадок наблюдается уже через несколько минут.
- Центрифугируйте при давлении 15 000 x g в течение 20 минут и держите надосадочную жидкость, содержащую термостабильный белок Tau
.
- Хранить при температуре -20 °C до следующего этапа очистки, если это необходимо.
- Проведите катионообменную хроматографию на прочной смоле CEX, упакованной в столбик объемом 5 мл, с использованием системы быстрой белковой жидкостной хроматографии (FPLC) (рис. 3 A).
- Установите скорость потока на 2,5 мл/мин.
- Уравновешивание столбца в буфере CEX A
- Загрузите 60-70 мл подогретого экстракта, содержащего тау, с помощью насоса для отбора проб или насоса А, в зависимости от системы. Соберите данные о протоке для анализа, чтобы убедиться, что тау-белок эффективно связывается со смолой (см. 2.8).
- Промойте смолу буфером CEX A до тех пор, пока абсорбция на длине волны 280 нм не вернется к исходному значению.
- Элюируйте Tau из колонки с помощью трехступенчатого градиента NaCl, полученного путем постепенного увеличения буфера CEX B (буфер CEX A с 1 M NaCl). Запрограммируйте FPLC следующим образом: первый шаг градиента до 25% буфера CEX B в 10 объемах (CV) для достижения 250 мМ NaCl, второй шаг до 50% буфера CEX B в 5 CV для достижения 500 мМ NaCl и третий шаг до 100% буфера CEX B в 2 CV для достижения 1 M NaCl. Соберите 1,5 мл фракций на этапах элюирования.
- Проанализируйте 10 мкл фракций, собранных на этапе элюирования с помощью SDS-PAGE (12% гель SDS-акриламида) и окрашивания Кумасси (рис. 3 A). Проверьте шаг загрузки колонны, проанализировав 10 мкл протока.
- Выберите дроби, содержащие Tau, и объедините эти дроби для следующего шага.
- Выполните буферную замену на Tau-содержащих объединенных дробях (рис. 3 B).
- Уравновесьте обессоливающую колонну слоя со смолой объемом 53 мл G25 (26 x 10 см) в бикарбонате аммония (летучий буфер) 50 мМ с помощью системы FPLC.
- Установите скорость потока на 5 мл/мин. Введите образец тау-белка в колонку через петлю для инъекции объемом 5 мл. Соберите фракции, соответствующие пику поглощения на длине волны 280 нм.
- Повторите инъекцию 3-4 раза, в зависимости от объема начального пула CEX.
- Рассчитайте количество очищенного тау-белка с помощью пиковой площади хроматограммы на длине волны 280 нм (1 мг тау-белка соответствует 140 мАЕ*мл).
заметка: Коэффициент экстинкции тау-белка при длине волны 280 нм составляет 7 550 М-1 см-1. Тау не содержит остатков Trp.
- Объедините все фракции Тау
.
- Разложите образец по пробиркам, содержащим эквивалент от 1 до 5 мг тау. Выбирайте эти пробирки так, чтобы объем раствора был небольшим по сравнению с объемом пробирки (например, 5 мл раствора в пробирке объемом 50 мл).
- Проделайте отверстия в крышках трубок с помощью иглы. Заморозьте образцы тау при температуре -80 °C.
- Лиофилизируйте образцы тау. Лиофилизированный тау-белок может сохраняться при температуре -20 °C в течение длительного периода времени.
3. Фосфорилирование in vitro 15N-тау
- Растворите 5 мг лиофилизированного тау в 500 мкл фосфорилированного буфера (50 мМ Hepes·KOH, pH 8,0, 12,5 мМ MgCl2, 1 мМ ЭДТА, 50 мМ NaCl).
- Добавьте 2,5 мМ АТФ (25 мкл 100 мМ стокового раствора, хранящегося при -20 °С), 1 мМ DTT (1 мкл 1 М стокового раствора, хранящегося при -20 °С), 1 мМ EGTA (2 мкл 0,5 М стокового раствора), 1 коктейль ингибиторов протеазы (25 мкл 40-кратного запаса, полученного растворением 1 таблетки в 1 мл фосфорилирующего буфера) и 1 мкМ активированный His-ERK2 (250 мкл в консервационном буфере 10 мМ Hepes, pH 7,3, 1 mM DTT, 5 mM MgCl2, 100 mM NaCl и 10% глицерина, хранящегося при -80 °C) в общем объеме образца 1 мл.<бр/>
заметка: Активированный His-ERK2 может быть получен внутри компании путем фосфорилирования с киназой MEK.
- Инкубировать 3 часа при 37 °C.
- Нагрейте образец до 75 °C в течение 15 минут, чтобы инактивировать киназу ERK.
- Центрифугируйте при 20 000 x g в течение 15 мин. Соберите и храните надосадочную жидкость.
- Обессолите образец белка до 50 мМ бикарбоната аммония с помощью колонки объемом 3,45 мл слоя, наполненного смолой G25 (1,3 x 2,6 см), который подходит для образца объемом 1 мл.
- Запустите 12% SDS-PAGE с 2,5 мкл образца белка, чтобы проверить его целостность и эффективное фосфорилирование (Рисунок 4).
- Лиофилизируйте фосфорилированный образец тау. Храните порошок при температуре -20 °C.
4. Получение спектров ЯМР (Рисунок 5)
- Растворите 4 мг лиофилизированного 15N, 13C ERK-фосфорилированного тау в 400 мкл ЯМР-буфера (50 мМ NaPi или 50 мМ дейтерированного Tris-d11. Cl, pH 6,5, 30 мМ NaCl, 2,5 мМ ЭДТА и 1 мМ DTT).
- Добавьте 5% D2O для блокировки поля спектрометра ЯМР и 1 мМ TMSP (3-(триметилсилил)пропионовая-2,2,3,3-d4 кислая натриевая соль)) в качестве внутреннего эталонного сигнала ЯМР. Добавьте 10 мкл 40-кратного стокового раствора полного коктейля ингибиторов протеазы.
- Перенесите образец в ЯМР-пробирку диаметром 5 мм с помощью электронного шприца с длинной иглой или пастеровской пипетки. Закройте ЯМР-трубку с помощью поршня. Удалите пузырьки воздуха, застрявшие между поршенем и жидкостью, движениями поршня.
- Поместите ЯМР-трубку в вращающуюся вертушку. Отрегулируйте его вертикальное положение в спиннере с помощью датчика, соответствующего используемой головке зонда ЯМР, таким образом, чтобы большая часть раствора образца находилась внутри катушки ЯМР.
- Запустите воздушный поток: нажмите кнопку «Лифт» в окне системы управления магнитом. Осторожно поместите блесну с трубкой в воздушный поток в верхней части отверстия магнита. Остановите поток воздуха (нажмите кнопку «Поднять») и дайте трубке опуститься на место внутри головки зонда в магните.
- Установите температуру на 25 °C (298 K).
- Выполните полуавтоматическую настройку и согласование пробной головки для оптимизации передачи мощности. Введите atmm в командной строке.
- Блокировка частоты спектрометра осуществляется с помощью сигнала D2O образца, записанного по дейтериевому каналу. Нажмите кнопку «Замок» в окне системы управления магнитом.
- Запустите процедуру шимминга для оптимизации однородности магнитного поля в месте нахождения образца. Введите topshim gui в командной строке, чтобы открыть окно оболочки поведения. Нажмите кнопку «Пуск» в окне оболочки совместимости. Проверьте остаточное значение стандартного изменения B0, чтобы убедиться в том, что регулировочные прокладки являются оптимальными (менее 2 Гц является хорошим).
- Калибруем параметр p1 (длина протонного радиочастотного импульса в μсек), который необходим для получения вращения спинов протонов на 90°. Нацельтесь на импульс 360°, используя одномерный спектр водных протонов (рис. 6).
- Отрегулируйте смещение частоты, установив параметр o1 (в Гц) на частоту протонной воды в 1D-спектре (рис. 6).
- Начните сбор одномерного протонного спектра (последовательность импульсов с последовательностью Уотергейта для подавления сигнала воды, например, zggpw5) для верификации сигналов от образца (рис. 7). Отрегулируйте количество сканирований в соответствии с относительной концентрацией белка. Введите zg в командной строке, чтобы начать сбор данных.
