1. Рабочая концентрация компонентов реакции
- Приготовьте рабочие концентрации буферов для CD в свежем виде и поддерживайте их при температуре 4 °C перед началом реакции.
заметка: Для реакций CD, описанных в данной работе, рабочие концентрации компонентов следующие: буфер фосфата натрия (pH 7,0) 1 мМ, АТФ 2 мМ, ДНК 500 нМ, белок 1 мкМ, MgCl2 10 мМ, ЭДТА 50 мМ, ADAADiN 5 мкМ.
2. Выбор и приготовление кювет для CD
- Собирайте спектры CD в кварцевые кюветы с высокой прозрачностью. Используйте прямоугольные или цилиндрические кюветы.<бр />
заметка: Для всех реакций, описанных в данной статье, использовалась кварцевая кювета CD (номинальный объем 0,4 мл, длина пути 1 мм).
- Для очистки кюветы используйте раствор для чистки кюветы. Добавьте 1% раствор для очистки кювет в воду, чтобы получилось 400 μл раствора, вылейте его в кювету и инкубируйте при 37 °C в течение 1 часа.
- Промойте кювету водой несколько раз, чтобы очистить кювету. Проведите сканирование воды или буфера в кювете, чтобы убедиться, что она чистая.
заметка: Вода или буфер должны давать показания в диапазоне от 0 до 1 mdeg.
3. Получение белков и олигонуклеотида ДНК
- Поддерживайте объем белка ниже 50 мкл в реакции, чтобы свести к минимуму количество буферных компонентов, которые иногда вызывают образование неоднозначных пиков. Держите белок на льду на протяжении всего эксперимента, чтобы избежать его деградации.
- Используйте в реакциях олигонуклеотиды, очищенные от PAGE.
заметка: В описанных здесь реакциях ДНК использовалась как в нативной, так и в термически охлаждаемой форме (быстро охлаждаемой (FC) и медленно охлаждаемой (SC)). Быстрое охлаждение способствует внутримолекулярным связям в ДНК, образуя больше вторичных структур. Напротив, медленное охлаждение способствует межмолекулярным связям в ДНК, что приводит к уменьшению количества вторичных структур.
- Для быстрого охлаждения нагрейте ДНК при температуре 94 °C в течение 3 минут на нагревательном блоке и сразу охладите его на льду. Для медленного охлаждения нагрейте ДНК при температуре 94 °C в течение 3 минут и дайте ей остыть до комнатной температуры со скоростью 1 °C в минуту.
4. Настройка контрольных экспериментов для записи базовых спектров
- Во всех реакциях поддерживайте реакционный объем на уровне 300 μл. Настройте в общей сложности 5 базовых реакций в центрифужных пробирках объемом 1,5 мл, одну за другой, следующим образом: i) Буфер + Вода; ii) Буфер + MgCl2 + АТФ + вода; iii) Буфер + MgCl2 + АТФ + белок + вода; iv) iii + ЭДТА или АДААДиН; v) Буфер + белок + вода.
5. Настройка экспериментов для записи спектров CD
- Настройте в общей сложности 5 реакций, одну за другой, в пробирках центрифуги объемом 1,5 мл следующим образом: i) Буфер + ДНК + Вода; ii) Буфер + ДНК + MgCl2 + АТФ + вода; iii) Буфер + ДНК + MgCl2 + АТФ + белок + вода; iv) iii + ЭДТА или АДААДиН; v) Буфер + ДНК + белок + вода.
6. Сканирование записи
- Включите газ и включите CD-спектрометр.
- Включите лампу через 10-15 мин. Включите водяную баню и установите температуру держателя на 37 °C.
- Откройте программное обеспечение CD spectrum.
- Установите температуру на 37 °C.
- Установите диапазон длин волн на 180 - 300 нм.
- Установите время на точку равным 0,5 с.
- Установите номер сканирования на 5.
- Нажмите на Pro-Data Viewer, создайте новый файл и переименуйте его, указав подробную информацию об эксперименте и дату.
- Держите все компоненты реакции на льду, чтобы избежать ухудшения. Проводите исходные линии и реакции, одну за другой, в пробирках центрифуги и смешивайте их с помощью пипетирования. Аккуратно переложите реакционную смесь в кювету, следя за тем, чтобы в ней не было пузырьков воздуха.
- Если вы проводите эксперимент по временному ходу, инкубируйте реакции при температуре 37 °C в течение необходимого времени и проведите сканирование. Добавьте ЭДТА в буфер, содержащий ДНК, АТФ, Mg+2 и белок, чтобы остановить гидролиз АТФ.
- Увеличивайте концентрацию ЭДТА и время его инкубации для полного ингибирования активности АТФазы.
- Вычтите базовые показатели из соответствующих реакций в программном обеспечении (например, вычтите реакцию 1 из базовой линии 1). Сгладьте данные либо в программном обеспечении для обработки спектра компакт-дисков, либо в программном обеспечении для построения графиков данных. Отобразите данные в программном обеспечении для построения графиков данных.
заметка: Вычитание базовых линий из соответствующих реакций даст чистые спектры CD только ДНК.
7. Анализ и интерпретация данных
- Используйте формулу, заданную уравнением (1), для преобразования значений, полученных в миллиградусах, в среднюю эллиптичность остатка.
Здесь S — сигнал CD в миллиградусах, c — концентрация ДНК в мг/мл, mRw — средняя масса остатка, а l — длина пути в см.
- Постройте график в зависимости от длины волны и эллиптичности средних остатков с помощью программного обеспечения для построения графиков данных и проанализируйте пики.
- Чтобы построить график, выберите эллиптичность среднего остатка по оси Y и длину волны по оси X и постройте график по прямой линии.
заметка: На этом графике будут представлены характерные пики различных форм ДНК. Формы ДНК, соответствующие пикам, могут быть идентифицированы с помощью существующей литературы.