$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Подготовка УФ-Визу/Рамановских зондов
- Приготовление голого раствора AuNP
- Приготовьте 2 мл раствора AuNPs с концентрацией примерно 1 x 1011 частиц на мл.
- Если необходимо концентрировать AuNP, заполните центрифужные пробирки с низкой связываемостью 2000 мкл исходного AuNP и центрифугируйте при 5000 x g в течение 20 мин или до тех пор, пока надосадочная жидкость не станет прозрачной. Удаляйте надосадочную жидкость с помощью пипетирования, стараясь не повредить гранулу AuNP.
- Объедините оставшиеся растворы AuNP в одну пробирку и оцените концентрацию, проведя измерение УФ-ВИД и сравнив значения с известными концентрациями, поскольку это линейная зависимость.
- Определение подходящего коэффициента маркировки рамановского репортера
- Приготовьте рабочий раствор рамановского репортера, растворенный в метаноле. Эта концентрация будет зависеть от используемого репортера. В этой работе готовят 3,3'-диэтилтиатрикарбоцианина йодид (ДТТК) в рабочем растворе 200 мкМ.
- Предполагая, что конечный объем для каждой лунки составляет 100 μл, добавьте достаточное количество рабочего раствора репортера в каждую лунку первого ряда 96-луночного планшета таким образом, чтобы концентрация рамановского репортера колебалась от 0,2 μМ до 10 μM. Добавьте достаточное количество воды для ВЭЖХ в каждую лунку так, чтобы объем составил 80 μл. Добавьте 20 μл AuNP в каждую лунку, получив окончательный объем 100 мкл на каждую лунку. Пример приведен в таблице 1.
- Измеряйте спектры УФ-ВИД в диапазоне от 400 до 700 нм с помощью УФ-ВИД спектрофотометра, считывающего пластины. Подходящей концентрацией является самая высокая концентрация с определенными пиками для УФ-ВИД спектров. Повторяйте шаг 2.2.2 при возрастании концентраций до тех пор, пока не будет найдено самое высокое отношение концентраций репортеров комбинационного рассеяния света к AuNPs.
заметка: Краситель и форма, размер и производитель AuNP влияют на соответствующую концентрацию. Поэтому перечисленные шаги должны быть оценены и изменены в зависимости от используемых компонентов. Этот протокол предполагал использование положительно заряженного красителя. Таким образом, связь между AuNP и репортером была улучшена за счет использования отрицательно заряженных AuNP. Это было сделано с помощью AuNP с цитратным покрытием. Более подробную информацию см. в разделе «Обсуждение».
- Привязка репортера Рамана и PEG-Ab к AuNP
- Приготовьте две партии по 1,5 мл AuNP и рамановского репортера в ранее определенной концентрации, дав возможность рамановскому репортеру связываться с AuNP в течение 30 мин при комнатной температуре.
- Добавьте ПЭГилированное антитело (PEG-Ab) в одну партию репортерного раствора AuNP и комбинационного рассеяния света, чтобы создать соотношение антител к частицам 200:1. Это решение будет для тестовых образцов. В отдельную микроцентрифужную пробирку добавьте PEGylated антиген к другой партии AuNP и репортерного раствора комбинационного рассеяния света в соотношении антитела к частицам 200:1, которые будут использоваться в качестве контроля. Инкубируйте растворы в течение 30 минут при комнатной температуре.
ПРИМЕЧАНИЕ: Соотношение антител к частицам будет специфичным для используемых AuNP и красителя и должно быть оптимизировано для каждого отдельного случая. Цель здесь состоит в том, чтобы получить максимальное соотношение антител для связывания зондов AuNP, предотвращая при этом агрегацию частиц. Используйте следующее уравнение, чтобы определить подходящие объемы для сложения:
где V – объем, а C – концентрация, выраженная в частицах или антителах на мл. Итоговый объем должен составлять примерно 1,5 мл.
- Заблокируйте оставшиеся участки на поверхности AuNP с помощью mPEG-SH.
- Приготовьте mPEG-SH путем растворения твердого метоксиполиэтиленгликоля тиола до концентрации 200 мкМ с помощью воды. Делайте раствор вихревым путем до полного растворения mPEG-SH.
- Добавьте mPEG-SH в соотношении 40 000:1 к решению AuNP-PEG-Ab, полученному на шаге 2.3. Инкубируйте раствор при комнатной температуре в течение 10 минут, чтобы убедиться, что оставшиеся участки на наночастице золота заблокированы. Используйте следующее уравнение, чтобы определить подходящие объемы для сложения:
где V – объем, а C – концентрация, выраженная в частицах или антителах на мл. Итоговый объем должен составлять примерно 1,5 мл.
- Восстановление функционализированных зондов комбинационного рассеяния света.
- Центрифугируйте частицы при давлении 5 000 x g в течение 20 мин в центрифужных пробирках с низким уровнем связывания или до тех пор, пока надосадочная жидкость не станет прозрачной. Удалите надосадочную жидкость с помощью пипетирования, стараясь не потревожить AuNPs.
- Суспендируйте частицы 1 мл 1x PBS раствора, который был приготовлен ранее. Оцените концентрацию AuNP путем измерения УФ-ВИД небольшого объема раствора (3 мкл) и сравните результаты с измерениями известной концентрации AuNP. Отрегулируйте объем таким образом, чтобы конечный раствор составлял не менее 1 х10 11 частиц на мл.
- Храните раствор при температуре 4 °C до тех пор, пока он не будет использован для функционализации иммуноферментной пластины. Используйте растворы в течение одной недели.
Таблица 1. Пример разбавления DTTC. Различные разведения DTTC и связанные с ними объемы исходного DTTC, раствор наночастиц золота и вода.
См.
мм
мм
мм
мм
| Объемы для добавления каждого компонента (мл) |
| DTTC Конечная концентрация (мМ) | Рабочее решение DTTC (200 мМ) | AuNP | Вода |
| 0,2 | 0,1 | 20 | 79,9 |
| 0,6 | 0,3 | 20 | 79,7 |
| 1 | 0,5 | 20 | 79,5 |
| 2 | 1.0 | 20 | 79 |
| 5 | 2.5 | 20 | 77,5 |
| 7 | 3.5 | 20 | 76,5 |
| 10 | 5,0 | 20 | 75 |
2. Подготовка иммуноферментной пластины
- Свяжите нужный антиген с иммуноферментной пластиной.
- Приготовьте достаточное количество разбавленных антигенов (50 мкг/мл) для заполнения полистирольных лунок. Перебейте раствор вихрем, и сразу же добавьте раствор в пластинчатые лунки. Дайте антигену закрепиться на пластинах в течение 1 часа при комнатной температуре.
- Смойте несвязанные антигены.
- Удалите избыток раствора антигена, вылив раствор в контейнер для утилизации и ударив тарелку о столешницу, покрытую бумажным полотенцем.
- Добавьте TBST в лунки, чтобы промыть поверхность, затем удалите смывку таким же образом, как указано ранее. Повторите этот шаг еще два раза.
- Заблокируйте оставшиеся места связывания на пластине, чтобы предотвратить неспецифическое связывание.
- Добавьте по 70 мкл раствора, блокирующего HSA, в каждую лунку планшета и инкубируйте при комнатной температуре в течение 30 минут.
- Снимите и промойте пластину, используя ту же процедуру, что указана в шаге 3.2. Накройте тарелку крышкой и храните в сухом виде при температуре 4 °C до готовности к дальнейшему использованию.
- Функционализируйте пластину для иммуноферментного анализа.
- Добавьте 70 мкл наночастиц зонда, приготовленных в разделе 2, в первую колонку 96-луночного планшета и разбавьте последующие колонки с помощью последовательного разведения 1:2. Дайте планшету поинкубироваться не менее 1 часа. Пример приготовления иммуноферментной пластины приведен на рисунке 1.
- Промойте пластину TBST пять раз, как описано в шаге 3.2, убедившись, что AuNP утилизированы надлежащим образом. После окончательной промывки добавьте 70 мкл 1x PBS в каждую лунку и накройте пластинчатым уплотнением.
ПРИМЕЧАНИЕ: Контрольные образцы должны быть чистыми. Если произошло неспецифическое связывание, контрольные образцы будут иметь цвет, аналогичный исследуемым образцам.
- Проверка чувствительности методом УФ-ВИД и рамановской спектроскопии.
- Для каждой скважины измерьте УФ-ВИД спектры в диапазоне от 400 до 700 нм с помощью пластинчатого УФ-ВИД спектрофотометра.
- С помощью инвертированного рамановского микроскопа сфокусируйте объектив на поверхности лунки, в которой установлены зонды AuNP. Получение спектров комбинационного рассеяния света скважины. Соберите спектр в диапазоне от 1 800 см-1 до 400 см-1. Повторите этот шаг для всех скважин.
- Используя соответствующее спектральное программное обеспечение, выполните коррекцию базовой линии полинома11-го порядка для спектров комбинационного рассеяния света и полином3-го порядка для спектров UV-VIS.
- Используя соответствующее спектральное программное обеспечение, нормализуйте спектры комбинационного рассеяния света и УФ-ВИД спектры. Установите максимальное значение равным 1 и масштабируйте все остальные значения соответственно. Чтобы нормализовать спектры комбинационного рассеяния, выберите уникальный полистирольный пик и установите его равным 1, а остальные значения масштабируйте соответственно.
- Используя соответствующее спектральное программное обеспечение, выполните интегрирование пиков для каждого спектра. Для спектров комбинационного рассеяния света пик, представляющий рамановский репортер, должен находиться в области, где отсутствуют полистирольные пики. Чтобы выполнить интегрирование пиков, укажите интегральные границы для нужного пика и запишите желаемую площадь пика для всех образцов, включая контрольные элементы.
- Постройте график средней пиковой области интереса в зависимости от логарифма концентрации AuNP с полосами погрешностей для каждой точки, указывающими на связанное с ней стандартное отклонение. Подгоньте эти точки калибровки к 4-параметрической логистической кривой.
- Определите среднее значение заготовки путем усреднения площади пика интереса для пустого образца. Определить стандартное отклонение этих участков; Это стандартное отклонение бланка.
- Для того же пика, проанализированного на предыдущем шаге, найдите стандартное отклонение этой пиковой области для самой низкой концентрации.
- Рассчитайте предел пустого и нижний предел обнаружения, как указано в разделе Репрезентативные результаты. Используйте эти значения с калибровочными кривыми 4PL для определения LLOD с точки зрения концентрации AuNP.
