Асептики лаборатории: Покрытие методы

Summary

При работе со средами и реагентами, используемыми для культивирования микроорганизмов, необходимо применять асептический метод, чтобы свести к минимуму загрязнение. Для выделения, размножения или перечисления бактерий и фагов обычно используются различные методы нанесения покрытий, каждый из которых включает в себя процедуры, поддерживающие стерильность экспериментальных материалов.

Abstract

Микроорганизмы присутствуют на всех неодушевленных поверхностях, создавая повсеместные источники возможного загрязнения в лаборатории. Успех эксперимента зависит от способности ученого стерилизовать рабочие поверхности и оборудование, а также предотвратить контакт стерильных инструментов и растворов с нестерильными поверхностями. Здесь мы представляем этапы нескольких методов нанесения покрытий, обычно используемых в лаборатории для выделения, размножения или перечисления микроорганизмов, таких как бактерии и фаги. Все пять методов включают в себя асептическую технику, или процедуры, которые поддерживают стерильность экспериментальных материалов. Описанные процедуры включают в себя: (1) нанесение полос на бактериальные культуры для выделения отдельных колоний, (2) заливку и (3) покрытие для подсчета жизнеспособных колоний бактерий, (4) наложение мягкого агара для выделения фагов и перечисления бляшек, а также (5) повторное покрытие для переноса клеток с одной пластины на другую в идентичной пространственной схеме. Эти процедуры могут быть выполнены на лабораторном стенде при условии использования непатогенных штаммов микроорганизмов (уровень биобезопасности 1, BSL-1). Если вы работаете с организмами BSL-2, то эти манипуляции должны проходить в шкафу биобезопасности. Ознакомьтесь с последней редакцией Паспорта биобезопасности в микробиологических и биомедицинских лабораториях (BMBL), а также с Паспортами безопасности материалов (MSDS) для инфекционных веществ, чтобы определить классификацию биологической опасности, а также меры предосторожности и условия локализации, необходимые для рассматриваемого микроорганизма. Штаммы бактерий и фаговые запасы могут быть получены от исследователей, компаний и коллекций, поддерживаемых определенными организациями, такими как Американская коллекция типовых культур (ATCC). Рекомендуется использовать непатогенные штаммы при изучении различных методов гальванического покрытия. Следуя процедурам, описанным в этом протоколе, студенты должны уметь:

● Выполняйте процедуры нанесения покрытий без загрязнения среды.
● Выделите одиночные колонии бактерий методом полосового покрытия.
● Используйте методы заливки и нанесения покрытия для определения концентрации бактерий><. ● Выполняйте наложения мягкого агара при работе с фагом.
● Перенос бактериальных клеток с одной пластины на другую с помощью процедуры репликации.
● Получив экспериментальную задачу, выберите подходящий способ нанесения покрытия.

Protocol

1. Подготовка безопасного и стерильного рабочего пространства

1. Ознакомьтесь со всеми лабораторными правилами и мерами безопасности, которые следует принимать при работе с микроорганизмами. Независимо от классификации биологической опасности, все материалы, которые приходят в контакт с микроорганизмами, считаются инфекционными отходами и должны быть дезактивированы до утилизации. Следуйте инструкциям по безопасности в соответствии с теми, которые предоставляются учреждениями департамента охраны здоровья и безопасности, настраивая соответствующие контейнеры для отходов для немедленного и правильного удаления потенциально загрязненных материалов (биологических опасностей).
2. Стерилизуйте все инструменты, растворы и среды перед использованием их для процедур нанесения.
3. Уберите все материалы, загромождающие ваше рабочее место на лабораторной стойке.
4. Очистите рабочую область с дезинфицирующим средством, чтобы минимизировать возможное загрязнение.
5. Настройте плиту Бунзена и работайте медленно, осторожно и внимательно в зоне стерильного поля, созданной восходящим потоком пламени.
   • Если вы работаете с организмами ВСЛ-2, настройте свое рабочее пространство в кабинете биобезопасности. В кабинете биобезопасности нельзя использовать плиту Бунзена, поскольку тепло от пламени нарушает поток воздуха, необходимый для ее функционирования.
6. Разместите все необходимые материалы для процедуры на лабораторной стойке вблизи стерильной зоны. Убедитесь, что все материалы правильно помечены. Организация рабочей зоны для максимизации эффективности работы и избегания ненужных движений минимизировала время воздействия опыта на воздушные загрязняющие вещества.
   • Разместите плиту Бунзена справа на стойке.
   • Разместите агар-пластины или чашки Петри слева.
   • Разместите клеточные культуры, пробирки, флаконы и бутылки в центре стойки.
   • Открутите крышки пробирок, флаконов и бутылок, чтобы их можно было легко открыть одной рукой при последующих манипуляциях.
7. Тщательно промойте руки с антисептическим мылом и теплой водой перед обращением с микроорганизмами.

2. Метод размазывания на пластинке: выделение бактериальных колоний методом квадрантов

Метод размазывания на пластинке предназначен для изоляции чистых культур бактерий, или колоний, из смешанных популяций путем простого механического разделения. Одиночные колонии состоят из миллионов клеток, растущих в кластере на или внутри агар-пластины (Рисунок 1). Колония, в отличие от одной клетки, видна невооруженным глазом. В теории, все клетки в колонии произошли от одного бактерии, первоначально осевших на пластине, и поэтому их называют клоном или кластером генетически идентичных клеток.

• Бактерии существуют в различных формах и размерах. Например, отдельные клетки Escherichia coli имеют форму палочек со средней длиной 2 мкм и шириной 0,5 мкм, в то время как клетки Streptococcus имеют сферическую форму со средним диаметром 1 мкм. Некоторые бактерии (например, E. coli) существуют в виде отдельных клеток, в то время как другие формируют различные формы ассоциации. Например, Streptococcus растет парами или образует цепочки или кластеры клеток. Обычно предполагается, что одна колония возникает от одной клетки, подвергающейся бинарному делению; однако, это предположение неверно для тех бактерий, которые естественно существуют в виде пар, цепочек или кластеров или которые делятся другими механизмами. Кроме того, если на пластинку нанести слишком много бактерий, то могут произойти перекрытия клеток и увеличится вероятность того, что две или более бактерий дадут начало тому, что кажется одной колоней. Для предотвращения этих осложнений при описании или перечислении бактериальных культур, растущих на твердом среде, колонии называются колониеобразующими единицами (кфе).

С помощью метода размазывания на пластинке смесь клеток распределяется по поверхности полужидкой агар-питательной среды в чашке Петри таким образом, что на поверхности среды в широко разнесенных точках откладывается все меньше и меньше бактериальных клеток, и после инкубации они развиваются в колонии. Здесь будет описан метод квадрантов для выделения одиночных колоний из смешанной популяции клеток.

1. Размазывание на пластинке можно выполнить с помощью различных инструментов (Рисунок 2). Металлический стержень можно использовать многократно и применяется для размазывания на пластинку рутинных лабораторных штаммов. Комерчески доступны одноразовые пластиковые стержни и чаще используются при работе с штаммами ВСЛ-2 в кабинете биобезопасности. Многие ученые предпочитают использ

Discussion

Культивирование микроорганизмов включает в себя ряд методов гальванического покрытия, каждый из которых требует соблюдения асептической техники на протяжении всего процесса манипуляций с клетками и средами. В этом протоколе было описано пять различных процедур. Несмотря на то, что эти методы нанесения покрытий обычно используются для манипулирования бактериями и фагами, они также могут быть применены к культурам клеток млекопитающих и эукариотическим микроорганизмам, обычно используемым в молекулярной генетике, таким как дрожжи (например, Saccharomyces cerevisiae, Candida albicans, Schizosaccharomyces pombe), водоросли и простейшие ( например, Volvox, Chlamydomonas, Amoeba, Paramecium) и нематоды (например, Caenorhabditis elegans). Существуют также многочисленные (и даже более сложные) вариации каждого метода гальванического покрытия в зависимости от цели эксперимента или изучаемого организма. Таким образом, важно не только выбрать наиболее подходящий метод для данного эксперимента или целевого микроорганизма, но и адаптировать методологию таким образом, чтобы результаты эксперимента адекватно отвечали исследовательскому вопросу или проблеме.

Некоторые из наиболее современных применений методов нанесения покрытий, обсуждаемых в этом протоколе, связаны с технологическими достижениями, которые дают высокопроизводительные результаты для экспериментов по скринингу и открытию лекарств. Например, центры секвенирования генома используют «метод Копакабана» для расширения библиотек клонов, которые представляют собой клетки E. coli , трансформируемые плазмидами, содержащими фрагменты ДНК, полученные из генома микроорганизма. Поскольку десятки больших тарелок (называемых лотками для биопроб) подготавливаются одновременно, для встряхивания стеклянных бусин используется автоматизированный встряхиватель для всей партии лотков. Кроме того, при отборе колоний из этих планшетов после инкубации используется роботизированный подборщик колоний для сбора клеток из соответствующих колоний в качестве инокулюма для LB-бульона в 384-луночных микропланшетах. Для этого высокопроизводительного скринингового анализа применяются процедурные принципы метода распыления пластин, но технология позволяет автоматизировать и масштабировать различные этапы, чтобы обеспечить одновременный анализ большого количества образцов и в течение короткого периода времени.

Биотехнологические и фармацевтические компании вкладывают значительные ресурсы в разработку высокопроизводительных технологий для самых основных методов в микробиологии и молекулярной генетике. Например, существуют многоканальные микропипетторы для одновременной передачи объема до 8 или 12 образцов. Существуют даже роботизированные рабочие станции, которые управляют 96-канальной головкой дозатора! В этих усилиях участвуют междисциплинарные команды ученых, объединяющие биологов, обладающих методологическими знаниями, с инженерами и программистами, которые могут разработать инструменты, необходимые для выполнения механических операций, связанных с экспериментами. Независимо от области применения исследований, цели, разделяемые компаниями, разрабатывающими эти технологии, одна и та же – автоматизировать лабораторные процессы, инструменты, системы и приборы, сделав их менее трудоемкими и более эффективными.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1. Дрожжевой триптон агар (YTA) < тело> <тр> <тр> <ТД>10,0 г <тр> <тр> <тд>до 1000,0 мл <тр> Автоклав на 121° C в течение 20 минут стерилизовать. Хранить при 4&�C. Если вы готовите пробирки для процедуры заливки, дайте агару остыть до ~55° Затем добавьте 2,0 мл 50 мг/мл циклогексимида. Асептически дозируйте 18,0 мл расплавленного агара на пробирку 18 мм, затем храните при температуре 4°C. Агар затвердеет, и перед использованием его нужно будет расплавить в пароварке или микроволновой печи. 2. Агар с минимальным содержанием солей (MSA) + 0,1% (w/v) источника углерода Экстракт дрожжей 2.0 г Tryptone Agar 15,0 г Дистиллированная вода pH 7,0 Автоклав на 121° C в течение 20 минут стерилизовать. Хранить при 4&�C. * Источники углерода, используемые для экспериментов, представленных на рисунке 13, включают ацетамид, лактозу и глицин. ** Раствор следовых солей готовится в 0,1 Н HCl следующим образом. Его добавляют в основу перед стерилизацией (автоклав при 121°; C в течение 20 минут). NH4Cl 1.0 г NH2HPO4• 2H2O KH2PO4 MgSO4• 7H2O 0,2 г Источник углерода* 1.0 г раствор следовых солей** Agar 15,0 г Дистиллированная вода pH 7,0 < тело> <тр> <тр> <ВД>2,14 г <тр> <ВД>1,09 г <тр> <тр> <тр> <тад>10,0 мл <тр> <тр> <тд>до 1000,0 мл <тр> < тело> <тр> <тр> <тад>180,0 мг <тр> <тад>130,0 мг <тр> <тад>40,0 мг <тр> <тад>20,0 мг <тр> < тад>1,0 мг <тр> <тад>1000,0 мг <тр> <тд>до 1000,0 мл 3. Мягкий агар ЭГА (0,65 % мас.) FeSO4• 7H2O 300.0 мг MnCl2• 4H2O Co(NO3)2• 6H2O ZnSO4.7H2O H2MoO4 CuSO4• 5H2O CaCl2 HCl (0,1 N) Автоклав на 121° C в течение 20 минут стерилизовать. Хранить при 4&�C. 4. Твердый агар EHA (1,2% по объему) Agar 6,5 г Tryptone NaCl Na Citrate• 2H2O 2.0 г Glucose 3.0 г Дистиллированная вода < тело> <тр> <тр> <ТД>13,0 г <тр> <ТД>8,0 г <тр> <тр> <тр> <тд>до 1000,0 мл < тело> <тр> <ТД>12,0 г <тр> <ТД>13,0 г <тр> <тр> <тр> <тад> 3,0 г <тр> <тд>до 1000,0 мл Автоклав на 121° C в течение 20 минут стерилизовать. Хранить при 4&�C. 5. 1X Верхний агар Миддлбрук (мягкий агар MBTA, 0,5% мас./об.) Agar Tryptone NaCl 8,0 г Na Citrate• 2H2O 2,0 г Glucose Дистиллированная вода Растопите 50 мл 2XTA и дайте ему остыть до ~55°C. Используя асептическую технику, добавьте CaCl2 и бульон 7H9 в растопленный агар. Асептически дозировать 4,5 мл смеси на тубу 13 мм и хранить при температуре 55°С; C инкубатор ≤ 7 дней. Охлаждение MBTA до комнатной температуры или 4°С; C приведет к тому, что CaCl2 выпадет в осадок из раствора. * 100 mM CaCl2. Запас необходимо хранить при комнатной температуре, чтобы предотвратить выпадение CaCl2 из раствора. ** Жидкая среда 7H9: Чистый 100 mM CaCl2 stock* 7H9: Neat ** 2XTA *** < тело> <тр> <тд> 1 мл <тр> Жидкая среда <тап>50 мл <тр> <тап>50 мл < тело> <тр> <тр> <тд>5 мл <тр> <тд>до 900,0 мл Смешайте основу с водой, затем добавьте глицерин, помешивая. Автоклав на 121° C в течение 20 минут стерилизовать. Хранить при 4&�C. *** 2X Middlebrook Top Agar (2XTA, 1,0% w/v) 7H9 бульонная основа 4,7 г 40% запасы глицерина Дистиллированная вода Автоклав на 121° C в течение 20 минут стерилизовать. Разложите аликвоты по 50 мл во флаконы по 100 мл и храните при температуре 4°C. 6. Пластины агара Миддлбрук 7H10 (твердый агар MHA, 1,9% по объему) 7H9 бульонная основа 4,7 г Agar 1.0 г Дистиллированная вода до 1000,0 мл < тело> <тр> <тр> <тр> < тело> <тр> Агаровая база <тр> <тд>12,5 мл <тр> <ТД>887,5 мл Смешайте основу агара с водой, затем добавьте глицерин, помешивая. Нагрейте раствор до кипения, затем помешивайте в течение одной минуты до полного растворения основного порошка. Автоклав на 121° C в течение 20 минут стерилизовать. Дайте агару остыть до ~55°°; Затем С асептически добавляют следующие реагенты: 7H10 19,0 г 40% запасы глицерина Дистиллированная вода * AD supplement AD (предварительно подогретая до 37°С; C)* 50 мг/мл Карбенициллин** < тело> <тр> Добавка <тд>100 мл <тр> <тад>1,0 мл <тр> <тд>10 мг/мл Циклогексимид** <тад>1,0 мл < тело> <тр> NaCl > 17 г > <тр> Альбумин (фракция V)> 100 г <тр> Dextrose (D-Glucose)> 40 г <тр> Дистиллированная вода> до 2000,0 мл Фильтр-стерилизуйте этот раствор; Не автоклавировать. Хранить при 4&�C. ** Фильтруйте-стерилизуйте и храните эти растворы при 4° C для ≤ 60 дней. 7. LB агар (1,5% w/v) + X-Gal (60 μ г/мл) < тело> <тр> <ТД>10,0 г <тр> <тр> <ТД>10,0 г <тр> <тр> <тд>до 1000,0 мл <тр> Tryptone Экстракт дрожжей 5,0 г NaCl Agar 15,0 г Дистиллированная вода pH 7,5 при 25°С; К Автоклав на 121° C в течение 20 минут стерилизовать. Дайте агару остыть до ~55°°; Затем асептически добавьте 3,0 мл 20 мг/мл раствора X-Gal. Свежеприготовленный бульон X-gal растворить 400 мг X-Gal в 20 мл диметилформамида (DMF). Таблица конкретных реагентов: < тело> <тр> <тр> <тр> <тр> <тр> <тр> <тр> <ТД>ВР 303-500 <тр> <тр> <тр> <тр> <тр> <тр> <ТД>М-3634 <тр> <тр> <тр> <тр> <тр> <тр> <тр> <тр> <тр> <тр> <тр> <тр> <тр> Агаровая база <тр> <тр> <тд>альбумин (фракция V) <тр> <тр> <тр> <тр> <тр> Таблица конкретного оборудования: Наименование реагента Company Каталожный номер Экстракт дрожжей Becton Dickenson 212750 Tryptone Becton Dickenson 211705 Agar Becton Dickenson 214030 NH4Cl Acros Organics 123340010 NH2HPO4• 2H2O Sigma-Aldrich 30435 KH2PO4 Fisher Scientific MgSO4• 7H2O Sigma-Aldrich 230391 Acetamide Sigma-Aldrich A-0500 Лактоза Fisher Scientific L6-500 Glycine Sigma-Aldrich G-7126 FeSO4• 7H2O Sigma-Aldrich F8048 MnCl2• 4H2O Sigma-Aldrich Co(NO3)2• 6H2O Sigma-Aldrich 230375 ZnSO4.7H2O Sigma-Aldrich Z4750 H2MoO4 Acros Organics 213621000 CuSO4• 5H2O Sigma-Aldrich 209198 CaCl2 Sigma-Aldrich C1016 HCl Fisher Scientific A144-212 Cycloheximide Sigma 038K1561 Carbenicillin Cellgro 46-100-RG NaCl Fisher S271-1 Na Citrate• 2H2O Fisher S279-500 глюкоза (декстроза) BD 215530 7H9 бульонная основа BD 271310 7H10 BD 262710 Glycerin Shelton IB15760 Fisher S71907 X-Gal (5-бром-4-хлор-3-индолил-β-D-галактопиранозид) Teknova X1205 Диметилформамид (DMF) Sigma D4551 Ethanol Fisher CDA19 Хлорный отбеливатель Chlorox 02490/06644884 CiDecon (дезинфицирующее средство) Decon Laboratories, Inc. 8504 Наименование оборудования Company Каталожный номер Experiment Металлические петли American Educational Products S17352 Streak plating Одноразовые пластиковые петли Fisher 22-363-602 Streak plating Деревянные палочки Fisher 23-400-104 Streak plating Плоские зубочистки American Educational Products S67859 Streak plating Поворотные столы Fisher 08-758Q Spread Plating Стеклянные стержни Bellco Glass NC9004380 Spread Plating 4 мм Fisher 11-312B Spread Plating Velveteen Bel-Art Products 09-718-2 Реплика гальванического покрытия Цилиндрический блок Bel-Art Products 09-718-1 Реплика гальванического покрытия < тело> <тр> <тр> <тр> <тр> <тр> <тр> <тр> <тр> Стеклянные шарики <тр> Вельветовая ткань <тр>