Асептики лаборатории: Покрытие методы

Краткое содержание

При работе со средами и реагентами, используемыми для культивирования микроорганизмов, необходимо применять асептический метод, чтобы свести к минимуму загрязнение. Для выделения, размножения или перечисления бактерий и фагов обычно используются различные методы нанесения покрытий, каждый из которых включает в себя процедуры, поддерживающие стерильность экспериментальных материалов.

Аннотация

Микроорганизмы присутствуют на всех неодушевленных поверхностях, создавая повсеместные источники возможного загрязнения в лаборатории. Успех эксперимента зависит от способности ученого стерилизовать рабочие поверхности и оборудование, а также предотвратить контакт стерильных инструментов и растворов с нестерильными поверхностями. Здесь мы представляем этапы нескольких методов нанесения покрытий, обычно используемых в лаборатории для выделения, размножения или перечисления микроорганизмов, таких как бактерии и фаги. Все пять методов включают в себя асептическую технику, или процедуры, которые поддерживают стерильность экспериментальных материалов. Описанные процедуры включают в себя: (1) нанесение полос на бактериальные культуры для выделения отдельных колоний, (2) заливку и (3) покрытие для подсчета жизнеспособных колоний бактерий, (4) наложение мягкого агара для выделения фагов и перечисления бляшек, а также (5) повторное покрытие для переноса клеток с одной пластины на другую в идентичной пространственной схеме. Эти процедуры могут быть выполнены на лабораторном стенде при условии использования непатогенных штаммов микроорганизмов (уровень биобезопасности 1, BSL-1). Если вы работаете с организмами BSL-2, то эти манипуляции должны проходить в шкафу биобезопасности. Ознакомьтесь с последней редакцией Паспорта биобезопасности в микробиологических и биомедицинских лабораториях (BMBL), а также с Паспортами безопасности материалов (MSDS) для инфекционных веществ, чтобы определить классификацию биологической опасности, а также меры предосторожности и условия локализации, необходимые для рассматриваемого микроорганизма. Штаммы бактерий и фаговые запасы могут быть получены от исследователей, компаний и коллекций, поддерживаемых определенными организациями, такими как Американская коллекция типовых культур (ATCC). Рекомендуется использовать непатогенные штаммы при изучении различных методов гальванического покрытия. Следуя процедурам, описанным в этом протоколе, студенты должны уметь:

● Выполняйте процедуры нанесения покрытий без загрязнения среды.
● Выделите одиночные колонии бактерий методом полосового покрытия.
● Используйте методы заливки и нанесения покрытия для определения концентрации бактерий><. ● Выполняйте наложения мягкого агара при работе с фагом.
● Перенос бактериальных клеток с одной пластины на другую с помощью процедуры репликации.
● Получив экспериментальную задачу, выберите подходящий способ нанесения покрытия.

Протокол

1. Подготовка безопасного и стерильного рабочего пространства

1. Ознакомьтесь со всеми правилами лабораторной работы и мерами предосторожности при работе с микроорганизмами. Независимо от класса биологической опасности, все материалы, контактировавшие с микроорганизмами, считаются инфекционными отходами и должны пройти деконтаминацию перед утилизацией. Соблюдайте правила техники безопасности в соответствии с инструкциями отделов охраны труда и экологической безопасности вашего учреждения; установите подходящие контейнеры для немедленной и правильной утилизации потенциально загрязненных материалов (биологически опасных отходов).
2. Стерилизуйте все инструменты, растворы и среды перед использованием их в процедурах посева.
3. Уберите все лишние материалы, загромождающие вашу рабочую зону на лабораторном столе.
4. Обработайте рабочую зону дезинфицирующим средством, чтобы свести к минимуму возможную контаминацию.
5. Подготовьте горелку Бунзена и работайте медленно, осторожно и обдуманно в пределах стерильной зоны, создаваемой восходящим потоком пламени.
   • При работе с организмами уровня BSL-2 организуйте рабочее пространство в боксе биологической безопасности. Горелку Бунзена нельзя использовать внутри бокса, так как тепло от пламени нарушает поток воздуха, необходимый для его функционирования.
6. Разместите все принадлежности, необходимые для процедуры, на лабораторном столе рядом со стерильной зоной. Убедитесь, что все материалы правильно промаркированы. Организация рабочего пространства для максимального повышения эффективности и исключения лишних движений позволит сократить время воздействия загрязняющих веществ из воздуха на экспериментальные материалы.
   • Поместите горелку Бунзена справа от вас на столе.
   • Поместите агарные пластины или чашки Петри слева от вас.
   • Расположите клеточные культуры, пробирки, колбы и флаконы в центре стола.
   • Приоткройте крышки пробирок, колб и флаконов, чтобы их можно было легко открыть одной рукой во время последующих манипуляций.
7. Тщательно вымойте руки с антисептическим мылом и теплой водой перед работой с микроорганизмами.

2. Процедура посева штрихом: изоляция бактериальных колоний с использованием метода квадратов

Метод посева штрихом предназначен для выделения чистых культур бактерий, или колоний, из смешанных популяций путем простого механического разделения. Одиночные колонии состоят из миллионов клеток, растущих группами на поверхности или внутри агаризованного слоя в чашке Петри (Рисунок 1). Колония, в отличие от отдельной клетки, видна невооруженным глазом. Теоретически все клетки в колонии происходят от одной бактерии, первоначально помещенной на чашку, и поэтому называются клоном, или группой генетически идентичных клеток.

• Бактерии имеют самые разные формы и размеры. Например, отдельные клетки Escherichia coli имеют палочковидную форму со средней длиной 2 μm и шириной 0.5 μm, в то время как клетки Streptococcus сферические со средним диаметром 1 μm. Некоторые бактерии (такие как E. coli) существуют в виде одиночных клеток, тогда как другие образуют определенные формы ассоциаций. Streptococcus, например, растут парами или образуют цепочки или скопления клеток. Обычно предполагается, что одна колония возникает из одной клетки, подвергающейся бинарному делению; однако это предположение неверно для тех бактерий, которые естественным образом существуют в виде пар, цепочек или скоплений, а также для тех, кто делится иными механизмами. Кроме того, если при посеве на чашку наносят слишком много бактерий, может произойти перекрывание клеток, что увеличит вероятность того, что две или более бактерии дадут начало тому, что кажется одной колонией. Чтобы избежать этих осложнений при описании или подсчете бактериальных культур, растущих на твердой среде, колонии называют колониеобразующими единицами (кое).

При использовании метода посева штрихом смесь клеток распределяют по поверхности полутвердой питательной среды на основе агара в чашке Петри таким образом, чтобы все меньшее количество бактериальных клеток оседало в широко разнесенных точках на поверхности среды и после инкубации развивалось в колонии. Здесь будет описан секторный метод выделения единичных колоний из смеси клеток.

1. Метод посева штрихом может быть выполнен с помощью нескольких различных инструментов (Рисунок 2). Металлическую петлю можно использовать многократно; она применяется для посева штрихом стандартных лабораторных штаммов. В продаже имеются одноразовые пластиковые петли, которые чаще используются при работе со штаммами уровня BSL-2 в боксе биологической безопасности. Многие исследователи предпочитают использовать одноразовые предварительно стерилизованные деревянные палочки или плоские зубочистки. Они являются недорогой альтернативой одноразовым пластиковым петлям и могут быть особенно полезны при работе с объектами окружающей среды, такими как почва, которая, вероятно, содержит спорообразующие бактерии.
   • Одноразовые стерилизованные палочки и зубочистки не требуют прокаливания на горелке Бунзена, что предотвращает ненужное аэрозолирование спорообразующих бактерий и перекрестное загрязнение лабораторных поверхностей или агаровых чашек спорами.
2. Маркируйте край дна (не крышки) агаровой чашки, указав как минимум ваше имя, дату, тип питательной среды и вид организма, который будет посеян на среду.
   • Перед посевом штрихом чашки должны быть полностью сухими, без конденсата на крышке, и предварительно прогреты до комнатной температуры. Если чашки хранились при 4 °C, извлеките их за несколько часов или даже за день до работы. Расставьте их небольшими ступенчатыми стопками по не более 2-3 чашек и дайте им высохнуть.
3. Образец, из которого будет производиться инокуляция, может представлять собой либо суспензию клеток в бульоне, либо существующую колонию с другой агаровой чашки. Для начала рекомендуется использовать только один образец для инокуляции одной чашки. Для экономии времени и материалов одну чашку можно использовать для нескольких образцов, но только после того, как вы в совершенстве овладеете техникой посева одного образца на чашку.
4. Для первого квадранта образец захватывают и распределяют примерно по одной четверти поверхности среды быстрыми, плавными движениями вперед-назад (Панель A Рисунка 3). Приподнимите нижнюю часть перевернутой чашки с поверхности стола. Многократно перемещайте петлю, палочку или зубочистку по поверхности агара от края к центру чашки.
   • Если инокулят представляет собой суспензию клеток, наберите одну петлю с помощью металлической петли или 5–10 μl с помощью микропипетки. Перед отбором аликвоты для посева обязательно перемешайте суспензию клеток или обработайте её вортексом. При выполнении этого шага соблюдайте правила асептики, прокаливая на огне не только петлю, но и горлышко флакона или пробирки до и после извлечения инокулята. Также не касайтесь стенок пробирки или флакона петлей или носиком микропипетки. При использовании пипетки нанесите суспензию клеток в соответствующее место на чашке, затем с помощью петли, палочки или зубочистки распределите её по первому квадранту чашки.
   • Если инокулят представляет собой колонию с другой чашки, осторожно коснитесь колонии петлей, палочкой или зубочисткой, затем распределите её по первому квадранту чашки. Убедитесь, что металлическая петля остыла перед касанием колонии. Чтобы убедиться, что петля не слишком горячая, слегка коснитесь агара в специально отведенной области, где посев не будет производиться. Для посева достаточно всего нескольких клеток из колонии, а не всей колонии целиком.
   • При использовании металлической петли прокалите её на горелке Бунзена перед набором инокулята для чашки (Панель B Рисунка 3). Начните примерно в 3–4 дюймах от петли, чтобы проволока находилась в кончике синего конуса — самой горячей части пламени. Металл должен раскалиться докрасна. Переместите проволоку так, чтобы пламя приблизилось к петле. Такая манипуляция предотвращает аэрозолирование бактерий, оставшихся на петле после предыдущего использования.
   • Прокаливание убивает бактерии (хотя и не споры), а конвекционные потоки нагретого воздуха предотвращают оседание других переносимых по воздуху загрязнителей на металлическую проволоку во время последующих манипуляций.
   • Если вы используете стерильную плоскую зубочистку, осторожно держите узкий конец большим и безымянным пальцами под углом 10–20° к среде, а широким концом выполняйте штрихование квадрантов. При использовании петли или деревянной палочки держите её как карандаш под тем же углом. Не давите слишком сильно, чтобы петля, палочка или зубочистка не врезались в агар.
5. Завершив работу с первым квадрантом, переверните чашку и поставьте её обратно на стол крышкой вниз. Утилизируйте палочку или зубочистку либо повторно прокалите металлическую петлю, как описано в шаге №4.
6. Поверните чашку Петри на 90°, чтобы посеять второй квадрант. Приподнимите нижнюю часть перевернутой чашки, затем коснитесь петлей, палочкой или зубочисткой первого квадранта в конце последнего штриха. Используя движение вперед-назад, пересеките последние штрихи в первом квадранте, а затем перейдите в пустой второй квадрант. Как только второй квадрант будет заполнен, переверните чашку и поставьте её обратно на стол крышкой вниз.
   • Петля, палочка или зубочистка ни в коем случае не должны возвращаться в первую половину штрихов первого квадранта, где был нанесен основной объем инокулята.
   • Для каждого квадранта следует использовать новую пластиковую петлю, деревянную палочку или зубочистку.
7. Повторите шаг №6 дважды для третьего и четвертого квадрантов.
   • Не забудьте утилизировать палочку или зубочистку или повторно прокалить металлическую петлю между посевом каждого квадранта.
   • При посеве четвертого квадранта избегайте захода в первый квадрант.
8. Инкубируйте чашку в перевернутом виде, чтобы конденсат, скапливающийся на крышке, не капал на колонии.

3. Метод посева в глубокий слой агара: подсчет количества бактериальных клеток в смешанном образце

Этот метод часто используется для подсчета количества микроорганизмов в смешанном образце, который добавляют в расплавленную агаровую среду до ее затвердевания. В результате этого процесса, при использовании соответствующего разведения образца, колонии равномерно распределяются по всему объему твердой среды. Данный метод применяется для проведения подсчета жизнеспособных клеток на чашках, при котором суммируется общее количество колониеобразующих единиц внутри агара и на поверхности агара на одной чашке. Подсчет жизнеспособных клеток предоставляет ученым стандартизированный способ построения кривых роста, расчета концентрации клеток в пробирке, из которой был взят образец для посева, а также изучения влияния различных условий среды или условий культивирования на выживаемость или скорость роста бактериальных клеток.

1. Промаркируйте край дна (не крышки) стерильной пустой чашки Петри, указав как минимум ваше имя, дату, тип питательной среды и вид организма, который будет добавлен в расплавленный агар.
   • Укажите коэффициент разведения, если вы высеваете последовательные разведения (серию повторных разведений, приводящую к систематическому снижению концентрации клеток в образце). Приготовление последовательных разведений необходимо, если количество клеток в образце превышает емкость агарной пластинки, при которой статистически значимый диапазон составляет от 30 до 300 cfu. Если на пластинке окажется более 300 cfu, колонии будут расположены слишком плотно и будут перекрывать друг друга.
2. Возьмите пробирку, содержащую 18 ml расплавленной агаровой среды.
   • Агаровую среду следует разлить по пробиркам и предварительно стерилизовать в автоклаве. В день проведения эксперимента агар необходимо расплавить в пароваре в течение 30 минут, а затем перенести в водяную баню при температуре 55 °C. Расплавлять следует только то количество агара, которое необходимо для эксперимента, так как повторно использовать его нельзя.
   • За десять минут до разливки пластинок пробирки с расплавленным агаром следует перенести из водяной бани (55 °C) на нагревательный блок лабораторного стола, установленный на 48 °C. Как только агар достигнет этой температуры, он будет готов к разливу. Если агар будет слишком горячим, бактерии в образце могут погибнуть. Если агар будет слишком холодным, после затвердевания среда может оказаться комковатой.
3. Подготовьте образец, который должен представлять собой либо бульонную культуру, либо суспензию клеток, полученную путем смешивания клеток из колонии с буфером или физиологическим раствором.
   • Образцы могут быть получены из серии разведений одного исходного образца.
   • Объем образца для высева должен составлять от 0.1 до 1.0 ml.
4. Откройте крышку пустой чашки Петри и внесите образец в центр пластинки (Панель A на Рисунке 4). Закройте крышку.
   • На протяжении всей процедуры соблюдайте правила асептики.
   • Для переноса образца на пластинку используйте серологическую пипетку или микропипетку. Контролируйте поток образца, чтобы он не выплеснулся из чашки.
5. Снимите колпачок с пробирки с расплавленным агаром и прокалите край открытой пробирки в пламени горелки Бунзена.
6. Откройте крышку чашки Петри с внесенным образцом и осторожно залейте агар (Панель B на Рисунке 4). Закройте крышку, затем перемешайте образец с агаром, осторожно вращая пластинку круговыми движениями.
7. Дайте агару полностью затвердеть, прежде чем переворачивать пластинку для инкубации.

4. Процедура посева методом распределения по поверхности: формирование отдельных бактериальных колоний для подсчета на чашках, обогащения, селекции или скрининга

Этот метод обычно используется для разделения микроорганизмов, содержащихся в небольшом объеме образца, который распределяют по поверхности чашки с агаром. При посеве подходящей концентрации клеток это приводит к образованию отдельных колоний, равномерно распределенных по поверхности агара. Помимо использования этой техники для подсчета жизнеспособных клеток на чашках, при котором подсчитывается общее количество колониеобразующих единиц на одной чашке и используется для расчета концентрации клеток в пробирке, из которой был взят обравзец, метод посева путем распределения по поверхности регулярно применяется в экспериментах по обогащению, селекции и скринингу. Желаемый результат для этих трех типов экспериментов обычно такой же, как и при подсчете клеток: формирование распределенных отдельных колоний по поверхности агара. Однако целью является не обеспечение роста всех жизнеспособных клеток. Вместо этого должны вырасти только те клетки в популяции, которые обладают определенным генотипом. Метод посева путем распределения по поверхности может быть предпочтительнее метода посева в агар при проведении экспериментов по количественному учету, если конечной целью является изоляция колоний для дальнейшего анализа, поскольку при этом колонии растут доступно на поверхности агара, тогда как при методе посева в агар они оказываются погруженными в толщу среды.

Здесь описаны две стратегии процедуры посева методом распределения по поверхности. Первая (Метод А) предполагает использование поворотного столика и стеклянного или металлического стержня в форме хоккейной клюшки. Вторая (Метод Б), называемая «методом Копакабана», основана на встряхивании предварительно стерилизованных стеклянных шариков. Оба способа способствуют равномерному распределению клеток по поверхности агара.

Метод А: Посев путем распределения по поверхности с использованием поворотного столика и стеклянного или металлического стержня

1. Сделайте маркировку по краю дна (не крышки) агарной чашки, указав как минимум ваше имя, дату, тип питательной среды и тип организма, который будет высеян на среду.
   • Укажите коэффициент разведения, если проводится посев серийных разведений.
   • Перед посевом методом посева по поверхности чашки должны быть полностью сухими, без конденсата на крышке, и предварительно доведены до комнатной температуры. Если чашки хранились при 4 °C, извлеките их за несколько часов или даже за день до использования. Разложите их небольшими стопками по 2-3 чашки в шахматном порядке и дайте им высохнуть.
2. Поместите чашку в центр поворотного стола (Рисунок 5).
3. Подготовьте образец, который должен представлять собой бульонную культуру или суспензию клеток, полученную путем смешивания клеток из колонии с буфером или физиологическим раствором.
   • Образцы могут быть получены из серии разведений одного исходного образца.
   • Объем образца для посева должен составлять от 0,1 до 0,2 ml.
4. Откройте крышку чашки Петри и внесите образец в центр агара. Закройте крышку.
   • На протяжении всей процедуры соблюдайте правила асептики.
   • Для переноса образца в чашку используйте микропипетку. Контролируйте поток образца, чтобы он не выплеснулся за пределы чашки.
5. Окуните стеклянный или металлический стержень (также называемый шпателем или распределителем) в стакан с 70% (v/v) этанолом.
   • ОСТОРОЖНО: Никогда не окунайте горячий шпатель в стакан со спиртом.
   • Этанол должен касаться только нижней части шпателя и первого дюйма стержня.
6. Слейте излишки этанола и подожгите их, пронеся шпатель через пламя горелки Бунзена.
   • Пламя должно пройти по всей длине шпателя и стержня, которые контактировали с этанолом, а затем быстро погаснуть.
   • Если спирт в стакане вспыхнет, не паникуйте! Накройте стакан стеклянной крышкой, чтобы быстро потушить огонь.
7. Откройте крышку агарной чашки, удерживая её в левой руке большим и указательным пальцами. Охладите шпатель, прикоснувшись им к агару по краю, рядом с ободком.
   • Не касайтесь агара в том месте, куда был внесен образец. Горячий шпатель убьёт клетки.
8. Медленно вращайте поворотный стол левой рукой (продолжая удерживать крышку агарной чашки).
   • Хотя этого следует избегать, если вам необходимо положить крышку, положите её лицевой стороной вниз на продезинфицированную поверхность в стерильной зоне горелки Бунзена. Если крышка лежит лицевой стороной вверх, возрастает риск контаминации из-за перемещения предметов или рук, что создает потоки воздуха, заставляя микроорганизмы и частицы пыли оседать на внутреннюю поверхность крышки.
9. Правой рукой осторожно прижмите шпатель к поверхности агара и постепенно равномерно распределите образец по всей чашке. Перемещайте шпатель вперед-назад по чашке во время вращения поворотного стола.
10. Дайте образцу полностью впитаться (минимум 5 минут), прежде чем перевернуть чашку для инкубации.

Метод B: Посев методом распределения с использованием стеклянных шариков: «метод Копакабана»

1. Промаркируйте край дна (не крышки) чашки с агаром, указав как минимум ваше имя, дату, тип питательной среды и вид организма, который будет высеян на среду.
   • Укажите коэффициент разведения, если вы высеваете серийные разведения.
2. Откройте крышку чашки с агаром, удерживая ее в левой руке большим и указательным пальцами. Затем откройте стеклянную пробирку или флакон с предварительно стерилизованными стеклянными шариками. Правой рукой прокалите горлышко пробирки или флакона, затем осторожно высыпьте 10-12 стерильных стеклянных шариков в чашку с агаром (Рисунок 6). Закройте крышку чашки, снова прокалите горлышко пробирки или флакона, после чего закройте его крышкой и отставьте в сторону.
   • Осторожно высыпайте шарики из пробирки или флакона на высоте нескольких сантиметров над агаром, чтобы они не выпрыгнули из чашки Петри.
   • Используйте стеклянные шарики диаметром 4 mm. Стерилизуйте их в стеклянных флаконах или пробирках в автоклаве при 121 °C в режиме сушки (гравитационный цикл) в течение 30 минут.
   • Одним из преимуществ использования шариков вместо шпателя является отсутствие необходимости в открытых емкостях с этанолом для повторного прокаливания.
3. Откройте крышку чашки с агаром и внесите образец в центр агара. Закройте крышку.
   • На протяжении всей процедуры соблюдайте правила асептики.
   • Вносите аликвоту образца объемом от 100 до 150 μl на одну чашку. Такой объем обеспечит равномерное распределение клеток. Для переноса образца в чашку используйте микропипетку. Контролируйте поток образца, чтобы он не выплеснулся за пределы чашки.
4. Распределите образец, аккуратно перемещая шарики по поверхности агара 6-7 раз. Чтобы клетки распределились равномерно, используйте горизонтальные трясущие движения.
   • Не вращайте шарики по кругу, иначе все клетки окажутся у края чашки.
   • ПОДСКАЗКА: При правильном выполнении процедура должна напоминать звук «тряски маракасов».
5. Поверните чашку на 60°, затем снова выполните горизонтальные трясущие движения 6-7 раз.
6. Поверните чашку на 60° второй раз и снова выполните горизонтальные трясущие движения. К этому моменту вы должны добиться равномерного распределения клеток по поверхности агара.
7. По завершении посева методом распределения образец должен быть поглощен, а поверхность агара — стать сухой. Высыпьте загрязненные шарики в маркированный стакан для сбора, содержащий 10% раствор хлорного отбеливателя.
   • Не выбрасывайте шарики в мусор! Использованные шарики будут промыты и автоклавированы для повторной стерилизации и дальнейшего использования.
   • ПРИМЕЧАНИЕ: Если поверхность агара все еще влажная после трехкратного встряхивания, оставьте чашку на несколько минут, чтобы жидкость впиталась в агар, затем повторите шаги №4–6 до тех пор, пока поверхность чашки не станет сухой.
8. Переверните чашку для инкубации.

5. Процедура наложения мягкого агара: формирование бляшек для изоляции и подсчета фагов (метод агаровых слоев)

Данный метод обычно используется для обнаружения и количественного определения бактериофагов (фагов), или бактериальных вирусов, размер которых составляет от 100 до 200 nm. Для визуализации отдельных частиц фагов требуется электронный микроскоп. Однако наличие инфекционных частиц фага можно обнаружить в виде бляшек на агаровой пластинке (Рисунок 7A). Фаги не могут реплицироваться вне своих бактериальных клеток-хозяев, поэтому для их размножения и обнаружения перед посевом необходимо смешать фаги и клетки-хозяева. При процедуре создания мягкого агарового слоя небольшой объем суспензии фага, обычно в диапазоне от 50 μl до 200 μl, дозируют в пробирку, содержащую около 10⁸ бактерий (клеток-хозяев), равномерно распределенных в 2,5-3,0 ml расплавленного мягкого (0,5-0,7% [w/v]) питательного агара. Полученную смесь выливают на поверхность плотного (1,5-1,9% [w/v]) питательного агара. Пластинку достаточно покачивают, чтобы мягкий агар покрыл всю поверхность плотного агара. Затем пластинку помещают на ровную поверхность до затвердевания верхнего слоя агара, после чего ее можно поместить в инкубатор.

Со временем во всей среде из мягкого агара становится видна мутная суспензия бактериальных клеток, называемая бактериальным газоном (Рисунок 7B). Бляшки образуются в том случае, если фаг инфицирует одну из бактериальных клеток, реплицируется внутри неё, а затем вызывает лизис клетки, высвобождая до 100 дочерних фагов (так называемый размер выхода). Новые частицы фага диффундируют в мягкий агар, инфицируя бактерии в области, окружающей лизированную бактериальную клетку. После нескольких циклов инфекции и лизиса мутная суспензия бактериальных клеток в мягком агаре исчезает, оставляя зону просветления, называемую бляшкой. Каждая бляшка содержит более 10⁹ частиц фага, которые генетически идентичны исходной инфекционной частице фага. Поскольку бляшка возникает из одной частицы фага, можно подсчитать итоговое число бляшкообразующих единиц (БОЕ) и рассчитать исходную концентрацию, или титр, суспензии фагов. Этот тип эксперимента, называемый методом агаровых слоев (или методом подсчета бляшек), также предоставляет ученым стандартизированный способ построения кривых одношагового роста, исследования специфичности диапазона хозяев и трансдукции бактериальных клеток для генетических экспериментов.

1. Подготовьте индикаторные бактерии: Для проведения эксперимента с использованием мягкого агарового слоя необходимо подготовить культуру бактериального штамма-хозяина, находящуюся в экспоненциальной фазе роста. Каждый штамм-хозяин имеет свои собственные требования к условиям культивирования. Для каждой чашки требуется от 0,3 мл до 0,5 мл суспензии индикаторных бактерий. При подготовке колбы с индикаторными бактериями (например, объемом 25 мл) культуру следует разделить на меньшие аликвоты (например, аликвоты по 5 мл, разлитые по стерильным пробиркам с завинчивающимися крышками), чтобы минимизировать возможность перекрестного загрязнения. Пробирки можно хранить на льду (при 4 °С) до начала использования в эксперименте. С помощью асептического метода инокулируйте стерильный питательный бульон, затем инкубируйте согласно спецификациям бактериального штамма. Остатки культур следует утилизировать в конце рабочего дня.
2. Подготовьте адсорбционные трубки: Поместите две стерильные микроцентрифужные пробирки в штатив. Подпишите крышку первой пробирки «Фаг», а крышку второй пробирки — «Контроль».
   • Как правило, последовательные разведения в случаях, когда готовятся и высеваются лизаты фагов, в штатив добавляются дополнительные микроцентрифужные пробирки, которые маркируются с указанием коэффициента разведения.
   • Запасы фагов следует готовить свежими из одиночных бляшек и хранить при 4°C. °в. Для дезагрегации частиц фагов перед проведением эксперимента стоки следует довести до комнатной температуры.
   • С запасами фагов следует обращаться осторожно: не используйте вортекс и избегайте интенсивного пипетирования.
3. Добавьте 50 μл вашего образца фага в первую пробирку, затем добавьте 50 μл фагового буфера во вторую пробирку, которая будет служить отрицательным контролем для анализа по методу агаровых слоев.
   • При всех манипуляциях с фагами и бактериями соблюдайте правила асептики.
4. Затем добавьте 500 μмл индикаторных бактерий в каждую адсорбционную трубку.
   • При длительном пребывании на льду или на рабочем столе бактериальные клетки оседают на дно пробирки. Если культуру не перемешать перед отбором аликвоты для эксперимента, в адсорбционную пробирку будет перенесено недостаточное количество бактериальных клеток. Для обнаружения бляшек в мягком агаре должно образоваться достаточное количество бактериальных колоний (т. е. сплошной газон). Перед переносом аликвот в адсорбционные пробирки используйте вортекс для осторожного ресуспендирования индикаторных бактерий до получения гомогенной суспензии.
5. Смешайте бактериальные клетки и фаги, осторожно встряхивая пробирки.
6. Инкубируйте смесь фага и бактерий в течение 15–20 минут (не более 30 минут) при температуре, соответствующей условиям культивирования индикаторного штамма.
7. Приготовьте чашки с питательным мягким и твердым агаром: Во время адсорбции возьмите две пробирки с мягким агаром (предварительно расплавленным и хранившимся при 55 °С) в нагревательном блоке на лабораторном столе, установленном на 46–48 °C °С.
   • Расплавленный мягкий агар необходимо выдерживать при температуре нагревательного блока в течение 10–15 минут для достижения теплового равновесия. Если расплавленный мягкий агар будет стоять более 15 минут, он начнет затвердевать, что приведет к образованию комков при выливании на твердый агар. Если время выдерживания расплавленного мягкого агара составит менее 10 минут, он будет слишком горячим при добавлении к смеси фагов и бактерий, что приведет к гибели клеток-хозяев до посева на чашки. В результате бактериальный газон может не сформироваться, и обнаружить будет можно лишь несколько бляшек или они будут полностью отсутствовать.
   • Подготовьте дополнительные пробирки с мягким агаром, если планируется посев серийных разведений лизата фагов.
8. Нанесите на край нижней части (не на крышку) двух чашек с питательным твердым агаром маркировку, включающую как минимум ваше имя, дату, тип питательной среды, а также надпись «Фаг» или «Контроль» в соответствии с адсорбционными пробирками.
   • При посеве серийных разведений добавьте дополнительные чашки, помеченные с указанием коэффициента разведения.
   • Чашки с плотным агаром должны быть полностью сухими, без конденсата на крышке, и предварительно прогреты до комнатной температуры перед добавлением мягкого агара. Если чашки хранились при 4 °C, удалите их за несколько часов или даже за день до начала работы. Разложите их небольшими ступенчатыми стопками не более 2–3 чашек и дайте им высохнуть. Избыточная влага в слое твердого агара приведет к разбавлению мягкого агара, что облегчит диффузию фагов через мягкий агар при формировании бляшек. Следовательно, размер бляшек увеличится.
9. Установите адсорбционные трубки на планшет по одной следующим образом: С помощью микродозатора P1000 асептически перенесите смесь фагов и бактерий (объем должен составлять приблизительно 550 μл) перенесите в пробирку с мягким агаром, затем быстро вращайте её между ладонями для перемешивания содержимого. НЕ трясите пробирку, чтобы избежать появления пузырьков воздуха. Держа пробирку в левой руке, правой рукой откройте крышку чашки с плотным агаром и немедленно Вылейте все содержимое пробирки на поверхность жесткого агаровой среды. Перед закрытием крышки осторожно, но быстро покачайте чашку, чтобы распределить расплавленный мягкий агар по всей поверхности среды до того, как он затвердеет. Избегайте попадания расплавленного мягкого агара на стенки чашки Петри. Закройте крышку.
10. Повторите шаг №9 для всех адсорбционных трубок. одна пробирка одновременно.
11. Поместите чашки на ровную поверхность и оставьте их в покое до полного затвердевания мягкого агара.
    • Обычно достаточно 30 минут.
12. Переверните планшеты для инкубации.
    • Несколько планшетов можно сложить в стопку, зафиксировать лентой и перевернуть для инкубации.

После инкубации чашки можно осмотреть на наличие бляшек. В отрицательном контроле должен быть виден только сплошной бактериальный газон (без отверстий, указывающих на наличие бляшек). Бляшки различаются по размеру, форме и общему виду. Конкретный тип фага можно выделить из гетерогенной смеси бляшек, осторожно вырезав центр одной бляшки стерильной зубочисткой и перенеся инокулят в стерильную микроцентрифужную пробирку, содержащую от 100 до 1000 μl бульона или фагового буфера. Полученный лизат можно посеять на чашки, используя ту же процедуру, что была описана выше. Для обеспечения чистоты выделенного фага необходимо провести как минимум от 3 до 6 последовательных циклов изоляции одной бляшки. Часто лизат приходится разводить в широком диапазоне (от 10^-1 до 10^-10), чтобы подобрать такой титр, который обеспечит появление неперекрывающихся бляшек на чашке. Это число варьируется в зависимости от размера бляшки.

6. Процедура создания репликационного планшета: перенос клеток для скрининга мутантов и ауксотрофов

Данный метод позволяет сравнивать рост клеток на первичной пластине с их ростом на вторичных пластинах, создавая возможность скрининга клеток на наличие селективного фенотипа. Сначала на первичную, или мастер-пластину, высевают клетки либо путем посева разведения, обеспечивающего рост одиночных колоний, либо путем переноса их на пластину в пространственном порядке, определенном сеточкой. На вторичные пластины, содержащие среду с ингибиторами роста или среду, в которой отсутствует определенный нутриент, переносят клетки из колоний с первичной пластины. Пространственный паттерн колоний воспроизводят, прижимая к первичной пластине отрез вельвета. Бактериальные клетки прилипают к вельвету, так как обладают большим сродством к нему, чем к агару. Затем отпечаток клеток на вельвете переносят на несколько вторичных пластин, при этом рост клеток отражает тот же паттерн колоний, что и на первичной пластине. Другими словами, это работает как резиновый штамп, копирующий схему роста с одной пластины на другую. Данный метод преимуществен тем, что он позволяет одновременно скринировать сравнительно большое количество колоний на многие фенотипы в рамках одного эксперимента.

1. Подготовка первичной чашки: На дне (не на крышке) чашки с агаром сделайте маркировку, указав как минимум ваше имя, дату и тип питательной среды.
2. На дне чашки нанесите сетку, состоящую как минимум из двух равноудаленных вертикальных и двух равноудаленных горизонтальных линий. Пронумеруйте получившиеся квадраты.
3. С помощью предварительно стерилизованной зубочистки инокулируйте каждый квадрат образцом клеток. Для каждого образца коснитесь центра квадрата. Не заполняйте клетками весь квадрат (Рисунок 8), иначе при инкубации образец чрезмерно разрастется и загрязнит соседние квадраты.
   • Каждый квадрат инокулируют разным образцом, полученным либо из бульонных культур, либо из колоний на другой чашке.
4. Переверните и инкубируйте первичную чашку, которая будет использоваться для инокуляции различных вторичных сред.
5. Инокуляция вторичных чашек: Сложите стопкой первичную чашку и все вторичные чашки. Маркером нанесите метку ориентации на боковой стороне чашек. Убедитесь, что метка находится на нижней части каждой чашки, а не на крышке.
6. Возьмите стерильную вельветовую ткань и поместите ее на цилиндрический блок (Рисунок 9). Зафиксируйте ткань с помощью держателя. Обратите внимание на метку ориентации на блоке.
   • Блок должен быть того же размера, что и дно чашки Петри (диаметром 10,2 cm). Он должен быть оснащен стопорным кольцом, которое прижимает вельветовую ткань к блоку во время репликации (отпечаточного метода).
   • Вельветовая ткань (квадраты 15,2 x 15,2 cm) должна быть предварительно стерилизована. Сложите стопкой 10 или 12 чистых квадратов, заверните их в алюминиевую фольгу и поместите в автоклав при 121 °C в режиме сушки (гравитационный цикл) на 30 минут. Перед использованием в эксперименте по репликации убедитесь, что они полностью высохли, выдержав их в теплом шкафу в течение нескольких часов. Обратите внимание, что перед стерилизацией с вельветовых квадратов может потребоваться удалить ворс с помощью малярного скотча.
   • Вельветовые квадраты можно использовать повторно. После деконтаминации в автоклаве использованные квадраты следует промыть в чистой воде и повторно стерилизовать, как описано выше.
   • Цилиндрический блок и зажим следует дезинфицировать между использованиями кратким промыванием в 70% (v/v) этаноле или 10% растворе хлорного отбеливателя.
7. Снимите крышку и переверните первичную чашку. Совместите метку ориентации на чашке с меткой на блоке. Опустите чашку так, чтобы поверхность агара соприкоснулась с вельветовой тканью на цилиндрическом блоке. Слегка, но равномерно надавите кончиками пальцев на заднюю часть первичной чашки, а затем осторожно поднимите ее с блока. Закройте чашку крышкой.
   • Вельветовый отпечаток клеток с первичной чашки можно использовать для инокуляции примерно 7–8 вторичных чашек, прежде чем потребуется сделать новый отпечаток на свежей ткани.
8. Повторите шаг №7 для каждой из вторичных чашек.
   • В качестве положительного контроля последняя чашка в серии должна содержать агаровую среду, на которой должны расти все тестируемые штаммы. Таким образом вы сможете подтвердить, что клетки были перенесены на все вторичные чашки серии. В противном случае отсутствие роста на конкретной тестовой среде может быть приписано недостаточному переносу клеток, а не фенотипу штамма.
   • Чтобы избежать ложноположительных результатов, вторичные чашки следует располагать в порядке от наименее благоприятного субстрата к наиболее благоприятному. В противном случае питательные вещества могут перенестись между чашками, позволяя клеткам расти на неблагоприятной среде.
9. Переверните чашки и инкубируйте.
   • Примечание: При проверке роста на вторичных чашках обязательно отличайте реальный рост от отпечатка. Последний является отрицательным результатом.

7. Очистка рабочего пространства

1. Выключите горелку Бунзена, затем уберите все материалы, включая культуры на чашках или в пробирках, излишки сред и другие реагенты.
   • Не допускайте накопления старых культур, будь то на чашках или в пробирках, на лабораторном столе или в местах хранения. Эти образцы, являющиеся известными источниками контаминации, такой как плесень и нежелательные виды бактерий, следует утилизировать сразу после того, как они перестанут быть необходимыми.
2. Поместите загрязненные лабораторные принадлежности (перчатки, наконечники для пипеток, салфетки Kimwipes), стеклянную посуду (пробирки, колбы, флаконы) и опасные отходы (бактериальные культуры или растворы фагов, использованные чашки) в соответствующий контейнер для утилизации. При работе с непатогенным штаммом E. coli (BSL-1) образуются только неинфекционные опасные отходы. При выполнении тех же процедур с патогенными организмами (BSL-2 и выше) образуются инфекционные опасные отходы. Независимо от класса биологической опасности, опасные отходы должны быть автоклавированы или продезинфицированы перед утилизацией. Следуйте рекомендациям, изложенным в BMBL (5^th Ed.), а также правилам вашего институционального отдела охраны окружающей среды, здоровья и безопасности (Environmental Health and Safety department) по немедленной и правильной утилизации биоопасных материалов, образовавшихся в ходе эксперимента.
3. Очистите рабочую зону дезинфицирующим средством.
4. Тщательно вымойте руки с антисептическим мылом и теплой водой перед выходом из лаборатории.

8. Типичные результаты

Метод посева штрихом. Пример нанесения образца при посеве штрихом показан на Рисунке 1. Эта процедура используется для изолирования бактериальных колоний из смешанных клеточных культур и является одной из наиболее важных методик, которыми необходимо владеть в микробиологии и молекулярной генетике. Каждая колония представляет собой популяцию генетически идентичных клеток. Для многих последующих приложений крайне важно начинать либо с одной колонии, либо с чистой бактериальной культуры, полученной путем инокуляции среды клетками из одной колонии. Например, с помощью светового микроскопа можно изучить морфологию отдельных клеток внутри колонии. Генетическая идентичность может быть определена путем секвенирования гена малой субъединицы рибосомной РНК из геномной ДНК, выделенной из клеточной культуры, созданной на основе одной колонии. Кроме того, метаболические характеристики могут быть описаны путем подвергания клеток различным биохимическим и физиологическим тестам. Только проведение таких экспериментов с чистыми культурами позволяет быть уверенным в свойствах, приписываемых конкретному микроорганизму. Результаты не будут искажены из-за возможного загрязнения культуры. Технические ошибки могут возникнуть, если стерильность инструмента, используемого для распределения клеток по поверхности чашки, не будет поддерживаться на протяжении всей процедуры. Отсутствие стерилизации петли в пламени или неиспользование новой зубочистки при переходе между квадрантами затрудняют получение одиночных колоний. Некоторые виды бактерий не могут быть выделены в чистую культуру, так как для определенных требований к росту они зависят от кооперативного взаимодействия с другим видом бактерий. Такие организмы, называемые синтрофами, могут расти только в условиях совместного культивирования, поэтому колонии (если они образуются) всегда будут состоять из двух или более видов. Еще одна сложность, возникающая в лаборатории при выполнении посева штрихом бактерий, выделенных из природных образцов, заключается в том, что такие клетки проявляют характеристики роста, отличающиеся от традиционных лабораторных штаммов, таких как E. coli. Такие бактериальные штаммы могут образовывать нитевидные колонии (в отличие от плотных скоплений клеток) с ветвями, распространяющимися на большую часть агарной пластины, кальцинированные и, следовательно, устойчивые к проникновению инструмента для посева, или окруженные липкой капсулой, из-за чего отдельные колонии невозможно различить. Эти особенности затрудняют очистку одиночных колоний методом посева штрихом.

Метод посева в массив агара. При использовании метода посева в массив агара колонии образуются как внутри агара, так и на поверхности питательной среды, что обеспечивает удобный способ подсчета количества жизнеспособных клеток в образце. Эта процедура применяется в различных областях промышленности. Например, для очистных сооружений, которые отвечают за очистку жидких отходов (например, сточных вод, стоков из ливневых канализаций), образующихся в результате бытовой, коммерческой и промышленной деятельности, а также сельскохозяйственной практики, крайне важно анализировать пробы воды после процесса глубокой очистки. Очищенные сточные воды (непитьевая вода) используются различными способами — для полива непищевых сельскохозяйственных культур, для санитарного смыва в жилых помещениях и в промышленных градирнях, поэтому они должны быть свободны от химического и микробиологического загрязнения. Питьевая вода должна очищаться в соответствии со стандартами EPA и тестироваться с использованием микробиологических методов посева, которые позволяют подсчитать количество конкретных патогенов, опасных для человека. На Рисунке 10 показаны бактериальные колонии, возникшие из бактериальных клеток, присутствовавших в пробе воды, взятой из общественного питьевого фонтана. Маловероятно, что эти колонии были образованы бактериальными патогенами, учитывая меры очистки питьевой воды; однако микробы повсеместны, и загрязнение даже непатогенными штаммами можно лишь минимизировать, но не устранить полностью. Еще одним примером является фармацевтическая компания, которой необходимо оценить степень микробиологического загрязнения, или биозагрузку, нового лекарственного препарата в процессе производства, хранения и транспортировки. Путем отбора проб препарата на различных этапах процесса и посева образцов методом посева в массив агара можно легко определить микробную нагрузку, или количество загрязняющих бактерий. После этого можно разработать меры предосторожности для минимизации или полного устранения микробиологического загрязнения. Одной из наиболее распространенных технических ошибок при выполнении метода посева в массив агара является недостаточное перемешивание образца с расплавленным агаром, что приводит к слипанию колоний, тем самым делая подсчет на чашках неточным. Другой частой ошибкой является разлив расплавленного агара, когда он слишком горячий, что приводит к гибели многих бактериальных клеток в образце. Эта ошибка также повлияет на точность подсчета, давая результаты, которые занижают общее количество колониеобразующих единиц в образце.

Метод посева путем распределения по поверхности (метод рассева). Метод посева путем распределения по поверхности аналогичен методу посева в глубокий слой агара по своему назначению как средство проведения подсчета жизнеспособных клеток на чашках. Однако, поскольку колонии, образующиеся при использовании метода рассева, равномерно распределены по поверхности агарной среды, клетки из отдельных колоний могут быть изолированы и использованы в последующих экспериментальных манипуляциях (например, в качестве инокулята для посева штрихом или для создания бульонной культуры). Тремя распространенными областями применения, в которых метод рассева является важным компонентом, являются эксперименты по обогащению, селекции и скринингу. Во всех трех случаях искомый тип клеток может быть отделен от смеси и в дальнейшем подвергнут любому количеству биохимических, физиологических или генетических тестов.

Эксперимент по обогащению заключается в посеве смешанной культуры на среду или инкубации планшетов в условиях окружающей среды, которые способствуют росту тех микроорганизмов в образце, которые обладают необходимыми метаболическими свойствами, характеристиками роста или определенным поведением. Эта стратегия не подавляет рост других организмов, но приводит к увеличению числа искомых микроорганизмов по сравнению с остальными организмами в культуре. Таким образом, колонии, образующиеся на чашке для обогащения, вероятно, проявляют фенотипические свойства, отражающие искомый генотип. Например, если целью является культивирование азотфиксирующих бактерий из образца окружающей среды, содержащего смесь более 1000 различных видов бактерий, то посев образца на среду с дефицитом азота позволит обогатить культуру теми бактериями, которые способны синтезировать это соединение из атмосферы, используя метаболические возможности, обеспечиваемые набором генов, необходимых для фиксации азота.

Эксперимент по селекции заключается в посеве смешанной культуры на среду, которая позволяет расти только тем клеткам, которые содержат определенный ген или набор генов. Такой тип эксперимента часто проводится в лабораториях молекулярной биологии при трансформации бактериальных штаммов плазмидами, содержащими гены устойчивости к антибиотикам. Если ваша цель — культивировать только рекомбинантные клетки, то есть те, которые успешно поглотили плазмиду, то посев образца на среду с соответствующей концентрацией антибиотика позволит отобрать клетки, проявляющие устойчивость к данному препарату.

Скрининговый эксперимент предполагает высев смешанной культуры на среду, позволяющую расти всем жизнеспособным клеткам; при этом клетки с искомым генотипом можно отличить от остальных по их фенотипу. Такой тип эксперимента часто применяется в лабораториях молекулярной биологии при проведении анализов на мутагенез или клонировании генов в плазмиды. Классический пример, показанный на Рисунке 11, основан на использовании гена lacZ, кодирующего β-галактозидазу; этот фермент позволяет клеткам метаболизировать X-Gal (5-бром-4-хлор-3-индолил-β-D-галактопиранозид), который является аналогом его природного субстрата — лактозы. Расщепление X-Gal β-галактозидазой приводит к образованию нерастворимого синего продукта. Таким образом, если среда содержит X-Gal, и на нее высевают образец с клетками, имеющими либо дикий (функциональный), либо мутантный (нефункциональный) ген lacZ, то после инкубации клетки дикого типа с функциональным геном lacZ будут выглядеть как синие колонии, в то время как мутантные клетки с нефункциональным геном lacZ будут выглядеть как беспигментные («белые») колонии.

Техническая проблема, с которой чаще всего сталкиваются при первом освоении метода посева на чашки с помощью распределителя, — это неравномерное распределение клеток по поверхности агара. При использовании поворотного столика и стеклянного стержня образец может впитаться слишком быстро, из-за чего колонии образуются только в центре чашки. При применении «метода Копакабана» стеклянные шарики могут вращаться, а не перемещаться встряхиванием по поверхности агара. В результате многие колонии вырастают вдоль внешнего края чашки. В обоих случаях полученное распределение колоний не позволяет использовать всю доступную площадь поверхности, поэтому клетки могут слипаться и перерастать в перекрывающиеся колонии, что делает подсчет на чашке неточным, а различение типов клеток невозможным.

Метод мягкого агарового слоя. Для подсчета количества фагов можно использовать процедуру, аналогичную методу посева на чашки (метод распределения по поверхности), применяемую для подсчета бактериальных колоний. Если при подсчете колоний на чашках (cfu/ml) на поверхность агара распределяют от 30 до 300 бактериальных клеток, то для подсчета бляшек (pfu/ml) от 100 до 400 инфекционных частиц фага смешивают с 10⁸–10⁹ клеток-хозяев в слое мягкого агара, распределенного по поверхности твердого питательного агара. Если не указано иное, обычно предполагается, что одна бактериальная клетка делится и накапливает большое количество генетически идентичных клеток в одном скоплении, называемом колонией. Как обсуждалось ранее, это предположение неверно, когда клетки растут группами (например, парами, тетрадами, цепочками или кластерами) или обладают такими характеристиками роста, как капсулы, которые препятствуют формированию одиночных колоний. Аналогичное предположение делается и для формирования бляшек: считается, что каждая бляшка представляет активность одного фага. Это утверждение верно только в том случае, если один фаг заражает одну бактерию. Что происходит, если одну бактерию заражают несколько частиц фага? Эта проблема связана с важным статистическим параметром, который необходимо учитывать при проведении экспериментов с фагами, — множественностью заражения (MOI), которая описывает соотношение инфекционных частиц фага к количеству клеток-хозяев в образце. Поскольку одни клетки адсорбируют более одного фага, в то время как другие адсорбируют только один или вовсе не адсорбируют фагов, популяцию клеток-хозяев следует заражать при низкой MOI (≤1), чтобы минимизировать вероятность заражения клетки более чем одной частицей фага. Использование единицы, образующей бляшку (pfu), в качестве функционального определения позволяет избежать этих осложнений при подсчете бляшек для расчета титра стока фага.

Как показано на Рисунке 12, морфология бляшек варьируется для разных фагов. Некоторые фаги образуют мелкие бляшки (панель A), в то время как другие дают крупные бляшки (панель B). На размер бляшки влияет ряд переменных. Существуют технические причины, способствующие этой вариабельности. Например, полные среды и толстый твердый агар способствуют развитию более крупных бляшек, поскольку клетки-хозяева могут поддерживать рост фагов в течение более длительного времени. Высокая плотность посева клеток-хозяев (>10⁹ cfu на чашку) приведет к уменьшению размера бляшек. Использование более низких концентраций мягкого агара увеличит скорость диффузии фаговых частиц в мягком агаре и, следовательно, увеличит размер бляшек. Следует помнить, что такая повышенная скорость диффузии может возникнуть непреднамеренно, если чашки с твердым агаром недостаточно просушены, в результате чего конденсат или избыточная влага в чашке разбавляют мягкий агар в верхнем слое. Такой технический недочет приведет к противоречивым результатам в отношении размера бляшек для конкретного фага.

Размер бляшки также зависит от ряда процессов в клетке-хозяине, включая эффективность адсорбции, продолжительность латентного периода (временной интервал от адсорбции фага до лизиса клетки-хозяина) и размер выхода (количество потомства, высвобождаемого при одной инфекции). Гетерогенная смесь бляшек разного размера может наблюдаться, если частицы фага инфицируют клетки-хозяева на разных фазах бактериального роста. Например, фаги, адсорбирующиеся в ранней экспоненциальной фазе, образуют более крупные бляшки с большим количеством потомства, чем те, что адсорбируются в поздней экспоненциальной фазе. Как общее правило, литические фаги образуют прозрачные бляшки, тогда как лизогенные фаги формируют мутные бляшки. Однако некоторые литические фаги создают интересные паттерны, такие как бляшка в виде «бычьего глаза», показанная на Рисунке 12B. Эти прозрачные бляшки окружены мутным ореолом, так как клетки по краю бляшки подвергаются неполному лизису или могут быть устойчивы к фаговой инфекции. Паттерн «бычьего глаза», наблюдаемый у умеренных фагов, представляет собой бляшку с мутным центром, окруженную прозрачным кольцом. Такая морфология отражает MOI и физиологическое состояние клетки-хозяина в контексте принятия решения между лизисом и лизогенией. Когда клетки впервые инфицируются фагом, MOI низок, а клетки растут быстро из-за обилия питательных веществ; в совокупности это способствует литическому росту. По мере лизиса все большего количества клеток MOI увеличивается, и формируется прозрачная бляшка. Однако лизогены в центре бляшки продолжают расти, так как они невосприимчивы к лизису, что приводит к образованию прозрачной бляшки с мутным центром.

Метод наложения можно модифицировать для проведения анализа бляшек с эукариотическими вирусами. Подобно тому как бактериофаги образуют бляшки на газоне бактериальных клеток в мягком агаре, эукариотические вирусы образуют бляшки на монослое клеток, покрытом гелем. Монослой представляет собой сплошной слой клеток, растущих бок о бок на поверхности культуральной чашки, соприкасаясь друг с другом, но не накладываясь друг на друга. Для проведения анализа бляшек такого типа аликвоты вируса добавляют к монослоям восприимчивых эукариотических клеток. Затем монослой покрывают питательной средой на основе агарозы — этот гель ограничивает распространение дочерних вирусов, выходящих из инфицированных клеток, на соседние клетки в монослое. В результате образуется сферическая область, или бляшка, содержащая клетки, поврежденные в результате выхода вирионов. Для облегчения визуализации бляшек к клеточной культуре можно добавить красители, окрашивающие живые клетки, чтобы создать контраст между инфицированными и неинфицированными клетками.

Метод покрытия мягким агаром используется в экспериментах, помимо анализа по методу определения количества бляшек. Во-первых, важно помнить, что твердый питательный агар представляет собой поддерживающую матрицу, обеспечивающую рост бактерий. Во-вторых, мягкий агар, используемый для покрытия, может иметь иной питательный состав, чем твердый агар. Таким образом, мягкий агар может служить средством анализа бактериальных штаммов на различные характеристики роста или метаболические свойства. Например, метод покрытия используется для скрининга бактерий на способность разлагать целлюлозу (Teather and Wood 1982). Одиночные колонии выращивают на неселективной твердой агаровой среде, затем на поверхность твердого агара наносят мягкий агар, содержащий 0,1% (w/v) карбоксиметилцеллюлозы (CMC). После инкубации чашки заливают красителем, который позволяет визуализировать зоны просветления вокруг колоний в мягком агаре. Просветление вызывается гидролитическими ферментами, секретируемыми бактериями и расщепляющими целлюлозу в среде. В последнее время метод покрытия применяется для обнаружения бактерий, подавляющих рост метаногенных Archaea, обитающих в рубце домашнего скота (Gilbert et al. 2010). Изоляты бактерий из образцов окружающей среды выращивают на твердой питательной агаровой среде, затем колонии покрывают мягким агаром, содержащим культуру метаногенов. После инкубации чашки осматривают на наличие зон торможения роста вокруг колоний. Этот метод позволяет идентифицировать бактериальные штаммы, которые вырабатывают ингибиторы метаногенов в мягком агаре.

Наиболее распространенными техническими ошибками при использовании метода мягкого агарового слоя являются разливание расплавленного мягкого агара при слишком высокой или слишком низкой температуре. Если агар слишком горячий, бактериальные клетки, смешанные с средой, погибнут еще до посева. Если же он слишком остыл, то при разливании на плотный агар мягкий агар будет образовывать комки. В обоих случаях результаты будут неоднозначными или, в лучшем случае, нечитаемыми.

Метод репликационного посева. Перенос культур с одного типа питательной среды на другой для проверки требований к росту становится весьма трудоемким процессом, если исследуется более нескольких штаммов. Репликационный посев — это метод, позволяющий проводить одновременный скрининг большого количества микроорганизмов. Например, после мутагенеза культуры клеток дикого типа можно сделать посев разведений культуры методом распределения по поверхности, чтобы получить чашки с единичными колониями. Первичные чашки содержат среду, поддерживающую рост всех клеток, включая прототрофы дикого типа, которые синтезируют все соединения, необходимые для роста, и мутантные ауксотрофы, имеющие генетическую мутацию в биосинтетическом пути, что делает их неспособными синтезировать определенные соединения, необходимые для роста. При посеве смеси клеток на полную среду недостающие питательные вещества поглощаются из окружающей среды. Чтобы отличить прототрофов от ауксотрофов, колонии можно реплицировать на минимальную среду. Расти смогут только прототрофы. Поскольку пространственное расположение колоний с первичной чашки сохраняется, сравнение вторичной чашки с первичной позволяет идентифицировать мутантные колонии. Чтобы определить, какое именно соединение мутанты более не способны синтезировать, колонии можно реплицировать на минимальные среды, дополненные специфическими соединениями (например, аминокислотами, источниками углерода, витаминами и т. д.). Таким образом, с помощью метода репликационного посева можно одновременно проскринировать сотни колоний. Одной из технических ошибок может быть использование слишком влажных агариков, что приводит к размазыванию колоний и контаминации всех культур на чашке. Это делает результаты совершенно недостоверными. Другой технической ошибкой является слишком сильное нажатие при переносе клеток с вельветовой ткани на вторичные чашки. В этом случае после инкубации вторичных чашек получившиеся колонии могут перекрывать друг друга, создавая фенотипы роста, которые ошибочно принимаются за ауксотрофию, хотя на самом деле являются следствием контаминации.

Не все микробные виды дикого типа являются прототрофами, поэтому метод репликационного посева может быть использован для одновременного скрининга различных штаммов дикого типа на наличие специфических требований к росту. Как показано на Рисунке 13, «порции» клеток четырех различных штаммов бактерий Pseudomonas были высеяны в дубликатах на чашку с нанесенной сеткой, содержащую полную среду YTA (панель A). Затем штаммы были реплицированы на три вторичные чашки (панели B, C и D), содержащие минимальную среду (MSA), дополненную различными источниками углерода (ацетамидом, лактозой и глицином соответственно). Результаты демонстрируют, что два из четырех штаммов Pseudomonas (P. aeruginosa и P. stutzeri) не способны расти на этих трех источниках углерода. В качестве контроля штаммы были реплицированы на четвертую чашку со средой YTA, чтобы подтвердить перенос клеток на протяжении всей процедуры. Поскольку все четыре штамма растут на контрольной чашке с YTA, дефицит роста, наблюдаемый на трех предыдущих чашках серии, является достоверным. Результаты репликационного посева представлены в Таблице 1. Одной из распространенных ошибок является интерпретация «отпечатка» роста на вторичной чашке как положительного результата. Например, сравните фенотип P. aeruginosa и P. stutzeri на MSA+ацетамид (панель B). Последний демонстрирует отпечаток роста, что является отрицательным результатом; такое может произойти, если питательные вещества с предыдущей чашки переносятся вместе с родительскими клетками. Новый рост клеток не происходит, так как необходимые питательные вещества недоступны для дочерних клеток. Отпечаток легко спутать с фактическим ростом. В случае сомнений эксперимент следует повторить, используя альтернативный метод, например, посев штрихом клеток с первичной чашки на вторичные среды.

Рисунок 1. Пример одиночных колоний на чашке. Розовые сферы ближе к центру чашки представляют собой колонии Serratia marcescens, грамотрицательной палочковидной протеобактерии семейства Enterobacteriaceae. Из-за предпочтения влажной среды этот микроорганизм часто встречается в углах ванн, в раковинах, в затирке плитки и на шторах для душа. S. marcescens легко распознать, так как она вырабатывает красноватый пигмент, называемый продигиозином. Колонии на этой чашке были получены методом посева штрихом, при этом одиночные колонии появились в четвертом квадранте после инкубации при 30 °C в течение 24 часов. В остальных трех квадрантах наблюдается слитный рост, при котором клетки, высеянные на поверхность агара, развились в перекрывающиеся колонии.

Рисунок 2. Инструменты, используемые для метода посева штрихом. Сверху вниз представлены зубочистки (плоские, не круглые), проволочная петля, одноразовая пластиковая петля и деревянные палочки. Зубочистки обычно помещают в небольшой стеклянный стакан широким концом вниз, после чего накрывают фольгой и подвергают автоклавированию для стерилизации перед использованием. Деревянные палочки помещают в пробирки диаметром 18 mm, затем стерилизуют в автоклаве перед использованием.

Рисунок 3. (A) Метод посева штрихом с использованием секториального способа. Предварительно стерилизованная петля, палочка или зубочистка используется для распределения образца по одной четверти поверхности агара быстрыми, плавными движениями вперед-назад от края к центру чашки. Это действие повторяется для каждого из четырех секторов чашки. После инкубации рост клеток наблюдается вдоль пути следования инструмента, которым клетки наносились на чашку. Механическое разделение клеток в смешанном образце с помощью этого метода должно привести к появлению одиночных колоний в четвертом секторе (см. пример на Рисунке 1). Одиночные колонии называют колониеобразующими единицами (кое). (B) При использовании металлической петли для посева штрихом ее необходимо стерилизовать в пламени горелки Бунзена перед контактом с инокулятом или агаровой средой. Напомним, что самой горячей частью пламени является вершина синего конуса. Держась за ручку инструмента, поместите проволоку в пламя примерно на 3-4 дюйма от петли. Оставьте ее там на достаточное время, чтобы проволока раскалилась докрасна. Переместите проволоку так, чтобы пламя охватило петлю. Убедитесь, что металлическая петля остыла перед касанием инокулята.

Рисунок 4. Метод посева в глубокий агар (метод посева в толщу среды). (A) Небольшой объем образца (от 0,1 до 1,0 ml) асептически переносят в пустую стерильную чашку Петри с помощью серологической пипетки на 5,0 ml. (B) Затем в чашку Петри с образцом заливают расплавленный агар, доведенный до температуры примерно 48 °C. После закрытия крышки чашку осторожно перемешивают круговыми движениями для смешивания образца и расплавленного агара. Агару дают застыть в течение примерно 30 минут, после чего чашки переворачивают для инкубации.

Рисунок 5. Метод посева образца на поверхность агара с использованием поворотного стола и стеклянного шпателя. После размещения чашки с агаром на поворотном столе небольшой объем образца (0,1–0,2 ml) асептически вносят в центр чашки с помощью микропипетки. Шпатель стерилизуют, погружая его в стакан с этанолом, а затем пронося через пламя горелки Бунзена для сжигания излишков этанола. Перед контактом с образцом шпатель следует охладить, прикоснувшись им к агару у края чашки. Шпатель осторожно перемещают вперед-назад по образцу по всей поверхности чашки, в то время как поворотный стол медленно вращается. Это действие обеспечивает постепенное и равномерное распределение образца по поверхности агара. После закрытия крышки чашку следует оставить на столе в неподвижном состоянии минимум на 5 минут, чтобы образец полностью впитался в агар перед переворачиванием чашки для инкубации.

Рисунок 6. Метод посева на поверхность агара с использованием стеклянных шариков (метод Копакабана). Предварительно стерилизованные в автоклаве стеклянные шарики насыпают на поверхность чашки с агаром, лежащей на лабораторном столе. Небольшой объем образца (100–150 μl) асептически вносят в центр агара с помощью микропипетки. При закрытой крышке чашки выполняют горизонтальные встряхивающие движения, чтобы осторожно перемещать шарики вперед-назад по поверхности чашки 6–7 раз для распределения образца. Эту операцию повторяют после поворота чашки на 60°. Встряхивание повторяют в третий раз после еще одного поворота на 60°. После полного впитывания образца в агаровую среду шарики высыпают в стакан с 10% раствором отбеливателя. Затем чашки переворачивают для инкубации.

Рисунок 7. Метод мягкого агарового слоя, используемый для изоляции и подсчета фагов на основе образования бляшек (также называемый методом определения титра фага с помощью бляшек). (A) Присутствие фага может быть обнаружено в виде зон просветления, или бляшек, на сплошной суспензии бактериальных колоний, растущих в мягком агаре. Фаг T4 представляет собой вирулентный фаг с двухцепочечной ДНК, который заражает своего хозяина, Escherichia coli, вызывая лизис клеток-хозяев и высвобождение дочерних фагов. После нескольких циклов инфекции и лизиса соседние клетки E. coli в непосредственной области вокруг первоначально зараженной клетки-хозяина исчезают, оставляя бляшку, содержащую миллиарды частиц фага T4. Фаг T4 образует бляшки диаметром примерно 1 mm. В данном эксперименте 200 µl разведения 10^-5 стокового раствора фага T4 с титром 2 x 10⁸ pfu/ml смешивали с примерно 300 µl индикаторных клеток E. coli, подготовленных в виде экспоненциально растущей аэрируемой культуры при 37 °C. И фаг, и бактерии добавляли в пробирку с мягким агаром EHA, перемешивали, а затем выливали на поверхность чашки с твердым агаром EHA. Обратите внимание, что в данном случае не было необходимости допускать адсорбцию фага на бактериях перед посевом. После того как мягкий агар застыл в неподвижном состоянии в течение 20 минут, чашки переворачивали и инкубировали при 37 °C в течение 24 часов. (B) В отсутствие инфицирующих частиц фага рост бактерий приводит к образованию мутной суспензии клеток в мягком агаре, в которой отдельные колонии не видны. Вместо этого во всем слое мягкого агара формируется равномерный бактериальный газон, в данном случае из клеток E. coli.

Рисунок 8. Подготовка основной (мастер-) пластины с бактериальными образцами. Для систематизации образцов дно пластины можно разделить разметкой на сетку, пронумеровав получившиеся квадраты. Каждому образцу присваивается свой квадрат сетки. Представлены примеры правильного и неправильного паттернов инокуляции. В идеале небольшое количество клеток переносят в центр квадрата с помощью стерильного инструмента для инокуляции, например, зубочистки, чтобы «промокнуть» образец (ячейка №4). Распространенные ошибки при инокуляции, такие как показанные в ячейке №5 («пятно») и ячейке №6 («заполнение»), приводят к чрезмерному росту бактериальных образцов после инкубации и, как следствие, к контаминации соседних квадратов.

Рисунок 9. Метод репликации (отпечаточного метода), используемый для переноса клеток с первичных на вторичные планшеты для фенотипического скрининга. Метка на первичной планшете совмещается с меткой на блоке, покрытом вельветом, который затем опускают до соприкосновения поверхности агара с тканью. Клетки переносятся с планшета на вельвет путем легкого, но равномерного нажатия на первичный планшет кончиками пальцев. Это действие оставит отпечаток образцов клеток на вельвете в том же пространственном расположении, что и на первичном планшете. Та же процедура используется для переноса клеток с вельвета на вторичный планшет. С помощью одного отпечатка с первичного планшета на вельвете можно инокулировать до 7-8 вторичных планшетов. Последний планшет, инокулированный с вельвета, должен служить положительным контролем. Это должна быть среда, поддерживающая рост всех тестируемых штаммов, что подтверждает достаточный перенос клеток во всей серии планшетов. После инкубации вторичные планшеты можно осмотреть и оценить по наличию или отсутствию роста. Таким образом, в одном эксперименте можно одновременно проводить скрининг нескольких бактериальных штаммов на различных средах роста.

Рисунок 10. Пример результата с использованием метода посева в глубокий слой агара. Образец воды объемом 1.0 ml, собранный из общественного питьевого фонтанчика, был перенесен в стерильную пустую чашку Петри. Затем в чашку с образцом залили расплавленный, но охлажденный YTA. Агар также содержал 100 μg/ml циклогексимида для предотвращения роста дрожжей и плесневых грибов, которые могли присутствовать в пробе воды. После осторожного перемешивания путем вращения чашку поместили на плоскую поверхность и дали агару полностью затвердеть. Чашку инкубировали при 37 °C в течение 48 часов. Представлен результат этого эксперимента. Обратите внимание на разницу во внешнем виде поверхностных колоний, которые имеют крупный круглый размер, и подповерхностных колоний, которые очень малы и имеют неправильную форму, так как затвердевшая среда препятствует распространению колоний в толще агара.

Рисунок 11. Пример результата с использованием метода посева путем распределения по поверхности (spread-plate technique). Для посева смеси клеток E. coli в ходе скринингового эксперимента был использован «метод Копакабана». В данном случае питательная среда (LB) содержит X-Gal, поэтому клетки, экспрессирующие функциональный фермент β-галактозидазу, образуют синие колонии, в то время как клетки с мутацией в гене lacZ, которые не способны экспрессировать функциональную β-галактозидазу, образуют белые колонии. Этот метод часто называют «сине-белым скринингом»; два типа колоний легко отличить друг от друга на одной чашке.

Рисунок 12. Пример результата метода агаровых слоев (plaque assay). Показаны бляшки, образованные на штамме-хозяине Mycobacterium smegmatis mc²155 (ATCC 700084) двумя разными фагами: (A) микобактериофагом Destroyers и (B) микобактериофагом MSSS. Эти фаги были выделены студентами в рамках лабораторного курса UCLA MIMG 103L весной 2010 года. M. smegmatis представляет собой непатогенную актинобактерию и принадлежит к семейству микобактерий, в которое входят несколько патогенов, вызывающих серьезные заболевания, такие как туберкулез (M. tuberculosis, M. africanum, M. bovis) и лепра (M. leprae). Примерно 50 μl разведения 10^-2 Destroyers и разведения 10^-3 MSSS инкубировали с 500 μl M. smegmatis в течение 20 минут при 37 °C, затем смешивали с MBTA (мягким агаром) и разливали в чашки с MHA (плотным агаром). После того как мягкий агар затвердел в покое в течение 20 минут, чашки переворачивали и инкубировали при 37 °C в течение 48 часов. Обратите внимание на различия в морфологии бляшек, создаваемых каждым фагом. Destroyers (A) образует небольшие (средний диаметр около 1 mm), прозрачные бляшки, характерные для литического фага, в то время как MSSS (B) формирует крупные бляшки типа «бычий глаз» с прозрачным центром, окруженным мутным ореолом (средний диаметр около 3.2 mm). Размытое кольцо может состоять из бактерий, устойчивых к фаговой инфекции. Эта картина отличается от той, которую создают лизогенные фаги, образующие мутные бляшки.

Рисунок 13. Пример результата использования метода репликации. Четыре штамма Pseudomonas (P. aeruginosa, P. putida, P. fluorescens и P. stutzeri) были протестированы в двух повторностях на способность к росту на трех различных источниках углерода: ацетамиде, лактозе и глицине. (A) Первичная чашка содержит полную среду (YTA), инокулированную четырьмя указанными штаммами. После инкубации при 30 °C в течение 24 часов все четыре штамма выросли на YTA. Первичная чашка использовалась для репликации на минимальную среду (MSA), дополненную одним источником углерода: ацетамидом (B), лактозой (C) и глицином (D). Последней чашкой в серии была чашка с положительным контролем на среде YTA (E). Как показано, штаммы демонстрируют различные паттерны роста после инкубации на вторичных чашках. Обратите внимание, что иногда трудно отличить рост от отпечатка клеток. Например, сравните отпечаток, оставленный P. stutzeri на трех чашках с MSA, с отсутствием роста P. aeruginosa на тех же трех чашках. Оба результата являются отрицательными по сравнению с паттернами роста P. putida и P. fluorescens. Однако все штаммы выросли на чашке с положительным контролем, что подтверждает перенос клеток на все вторичные чашки в серии. Результаты этого эксперимента сведены в Таблицу 1.

	YTA (основная среда)	MSA + ацетамид	MSA + лактоза	MSA + глицин	YTA (контроль)
P. aeruginosa	+	-	-	-	+
P. putida	+	+	+	+	+
P. fluorescens	+	+	+	+	+
P. stutzeri	+	-	-	-	+

Таблица 1. Сводные результаты пересева. Рост обозначен знаком плюс (+), отсутствие роста — знаком минус (-). YTA — полная среда (дрожжевой триптон-агар), MSA — минимальная среда (минимальный солевой агар). В среду MSA добавляли один источник углерода, как указано в таблице.

Обсуждение

Культивирование микроорганизмов включает в себя ряд методов гальванического покрытия, каждый из которых требует соблюдения асептической техники на протяжении всего процесса манипуляций с клетками и средами. В этом протоколе было описано пять различных процедур. Несмотря на то, что эти методы нанесения покрытий обычно используются для манипулирования бактериями и фагами, они также могут быть применены к культурам клеток млекопитающих и эукариотическим микроорганизмам, обычно используемым в молекулярной генетике, таким как дрожжи (например, Saccharomyces cerevisiae, Candida albicans, Schizosaccharomyces pombe), водоросли и простейшие ( например, Volvox, Chlamydomonas, Amoeba, Paramecium) и нематоды (например, Caenorhabditis elegans). Существуют также многочисленные (и даже более сложные) вариации каждого метода гальванического покрытия в зависимости от цели эксперимента или изучаемого организма. Таким образом, важно не только выбрать наиболее подходящий метод для данного эксперимента или целевого микроорганизма, но и адаптировать методологию таким образом, чтобы результаты эксперимента адекватно отвечали исследовательскому вопросу или проблеме.

Некоторые из наиболее современных применений методов нанесения покрытий, обсуждаемых в этом протоколе, связаны с технологическими достижениями, которые дают высокопроизводительные результаты для экспериментов по скринингу и открытию лекарств. Например, центры секвенирования генома используют «метод Копакабана» для расширения библиотек клонов, которые представляют собой клетки E. coli , трансформируемые плазмидами, содержащими фрагменты ДНК, полученные из генома микроорганизма. Поскольку десятки больших тарелок (называемых лотками для биопроб) подготавливаются одновременно, для встряхивания стеклянных бусин используется автоматизированный встряхиватель для всей партии лотков. Кроме того, при отборе колоний из этих планшетов после инкубации используется роботизированный подборщик колоний для сбора клеток из соответствующих колоний в качестве инокулюма для LB-бульона в 384-луночных микропланшетах. Для этого высокопроизводительного скринингового анализа применяются процедурные принципы метода распыления пластин, но технология позволяет автоматизировать и масштабировать различные этапы, чтобы обеспечить одновременный анализ большого количества образцов и в течение короткого периода времени.

Биотехнологические и фармацевтические компании вкладывают значительные ресурсы в разработку высокопроизводительных технологий для самых основных методов в микробиологии и молекулярной генетике. Например, существуют многоканальные микропипетторы для одновременной передачи объема до 8 или 12 образцов. Существуют даже роботизированные рабочие станции, которые управляют 96-канальной головкой дозатора! В этих усилиях участвуют междисциплинарные команды ученых, объединяющие биологов, обладающих методологическими знаниями, с инженерами и программистами, которые могут разработать инструменты, необходимые для выполнения механических операций, связанных с экспериментами. Независимо от области применения исследований, цели, разделяемые компаниями, разрабатывающими эти технологии, одна и та же – автоматизировать лабораторные процессы, инструменты, системы и приборы, сделав их менее трудоемкими и более эффективными.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
1. Дрожжевой триптон агар (YTA) < тело> <тр> <тр> <ТД>10,0 г <тр> <тр> <тд>до 1000,0 мл <тр> Автоклав на 121° C в течение 20 минут стерилизовать. Хранить при 4&�C. Если вы готовите пробирки для процедуры заливки, дайте агару остыть до ~55° Затем добавьте 2,0 мл 50 мг/мл циклогексимида. Асептически дозируйте 18,0 мл расплавленного агара на пробирку 18 мм, затем храните при температуре 4°C. Агар затвердеет, и перед использованием его нужно будет расплавить в пароварке или микроволновой печи. 2. Агар с минимальным содержанием солей (MSA) + 0,1% (w/v) источника углерода Экстракт дрожжей 2.0 г Tryptone Agar 15,0 г Дистиллированная вода pH 7,0 Автоклав на 121° C в течение 20 минут стерилизовать. Хранить при 4&�C. * Источники углерода, используемые для экспериментов, представленных на рисунке 13, включают ацетамид, лактозу и глицин. ** Раствор следовых солей готовится в 0,1 Н HCl следующим образом. Его добавляют в основу перед стерилизацией (автоклав при 121°; C в течение 20 минут). NH4Cl 1.0 г NH2HPO4• 2H2O KH2PO4 MgSO4• 7H2O 0,2 г Источник углерода* 1.0 г раствор следовых солей** Agar 15,0 г Дистиллированная вода pH 7,0 < тело> <тр> <тр> <ВД>2,14 г <тр> <ВД>1,09 г <тр> <тр> <тр> <тад>10,0 мл <тр> <тр> <тд>до 1000,0 мл <тр> < тело> <тр> <тр> <тад>180,0 мг <тр> <тад>130,0 мг <тр> <тад>40,0 мг <тр> <тад>20,0 мг <тр> < тад>1,0 мг <тр> <тад>1000,0 мг <тр> <тд>до 1000,0 мл 3. Мягкий агар ЭГА (0,65 % мас.) FeSO4• 7H2O 300.0 мг MnCl2• 4H2O Co(NO3)2• 6H2O ZnSO4.7H2O H2MoO4 CuSO4• 5H2O CaCl2 HCl (0,1 N) Автоклав на 121° C в течение 20 минут стерилизовать. Хранить при 4&�C. 4. Твердый агар EHA (1,2% по объему) Agar 6,5 г Tryptone NaCl Na Citrate• 2H2O 2.0 г Glucose 3.0 г Дистиллированная вода < тело> <тр> <тр> <ТД>13,0 г <тр> <ТД>8,0 г <тр> <тр> <тр> <тд>до 1000,0 мл < тело> <тр> <ТД>12,0 г <тр> <ТД>13,0 г <тр> <тр> <тр> <тад> 3,0 г <тр> <тд>до 1000,0 мл Автоклав на 121° C в течение 20 минут стерилизовать. Хранить при 4&�C. 5. 1X Верхний агар Миддлбрук (мягкий агар MBTA, 0,5% мас./об.) Agar Tryptone NaCl 8,0 г Na Citrate• 2H2O 2,0 г Glucose Дистиллированная вода Растопите 50 мл 2XTA и дайте ему остыть до ~55°C. Используя асептическую технику, добавьте CaCl2 и бульон 7H9 в растопленный агар. Асептически дозировать 4,5 мл смеси на тубу 13 мм и хранить при температуре 55°С; C инкубатор ≤ 7 дней. Охлаждение MBTA до комнатной температуры или 4°С; C приведет к тому, что CaCl2 выпадет в осадок из раствора. * 100 mM CaCl2. Запас необходимо хранить при комнатной температуре, чтобы предотвратить выпадение CaCl2 из раствора. ** Жидкая среда 7H9: Чистый 100 mM CaCl2 stock* 7H9: Neat ** 2XTA *** < тело> <тр> <тд> 1 мл <тр> Жидкая среда <тап>50 мл <тр> <тап>50 мл < тело> <тр> <тр> <тд>5 мл <тр> <тд>до 900,0 мл Смешайте основу с водой, затем добавьте глицерин, помешивая. Автоклав на 121° C в течение 20 минут стерилизовать. Хранить при 4&�C. *** 2X Middlebrook Top Agar (2XTA, 1,0% w/v) 7H9 бульонная основа 4,7 г 40% запасы глицерина Дистиллированная вода Автоклав на 121° C в течение 20 минут стерилизовать. Разложите аликвоты по 50 мл во флаконы по 100 мл и храните при температуре 4°C. 6. Пластины агара Миддлбрук 7H10 (твердый агар MHA, 1,9% по объему) 7H9 бульонная основа 4,7 г Agar 1.0 г Дистиллированная вода до 1000,0 мл < тело> <тр> <тр> <тр> < тело> <тр> Агаровая база <тр> <тд>12,5 мл <тр> <ТД>887,5 мл Смешайте основу агара с водой, затем добавьте глицерин, помешивая. Нагрейте раствор до кипения, затем помешивайте в течение одной минуты до полного растворения основного порошка. Автоклав на 121° C в течение 20 минут стерилизовать. Дайте агару остыть до ~55°°; Затем С асептически добавляют следующие реагенты: 7H10 19,0 г 40% запасы глицерина Дистиллированная вода * AD supplement AD (предварительно подогретая до 37°С; C)* 50 мг/мл Карбенициллин** < тело> <тр> Добавка <тд>100 мл <тр> <тад>1,0 мл <тр> <тд>10 мг/мл Циклогексимид** <тад>1,0 мл < тело> <тр> NaCl > 17 г > <тр> Альбумин (фракция V)> 100 г <тр> Dextrose (D-Glucose)> 40 г <тр> Дистиллированная вода> до 2000,0 мл Фильтр-стерилизуйте этот раствор; Не автоклавировать. Хранить при 4&�C. ** Фильтруйте-стерилизуйте и храните эти растворы при 4° C для ≤ 60 дней. 7. LB агар (1,5% w/v) + X-Gal (60 μ г/мл) < тело> <тр> <ТД>10,0 г <тр> <тр> <ТД>10,0 г <тр> <тр> <тд>до 1000,0 мл <тр> Tryptone Экстракт дрожжей 5,0 г NaCl Agar 15,0 г Дистиллированная вода pH 7,5 при 25°С; К Автоклав на 121° C в течение 20 минут стерилизовать. Дайте агару остыть до ~55°°; Затем асептически добавьте 3,0 мл 20 мг/мл раствора X-Gal. Свежеприготовленный бульон X-gal растворить 400 мг X-Gal в 20 мл диметилформамида (DMF). Таблица конкретных реагентов: < тело> <тр> <тр> <тр> <тр> <тр> <тр> <тр> <ТД>ВР 303-500 <тр> <тр> <тр> <тр> <тр> <тр> <ТД>М-3634 <тр> <тр> <тр> <тр> <тр> <тр> <тр> <тр> <тр> <тр> <тр> <тр> <тр> Агаровая база <тр> <тр> <тд>альбумин (фракция V) <тр> <тр> <тр> <тр> <тр> Таблица конкретного оборудования: Наименование реагента Company Каталожный номер Экстракт дрожжей Becton Dickenson 212750 Tryptone Becton Dickenson 211705 Agar Becton Dickenson 214030 NH4Cl Acros Organics 123340010 NH2HPO4• 2H2O Sigma-Aldrich 30435 KH2PO4 Fisher Scientific MgSO4• 7H2O Sigma-Aldrich 230391 Acetamide Sigma-Aldrich A-0500 Лактоза Fisher Scientific L6-500 Glycine Sigma-Aldrich G-7126 FeSO4• 7H2O Sigma-Aldrich F8048 MnCl2• 4H2O Sigma-Aldrich Co(NO3)2• 6H2O Sigma-Aldrich 230375 ZnSO4.7H2O Sigma-Aldrich Z4750 H2MoO4 Acros Organics 213621000 CuSO4• 5H2O Sigma-Aldrich 209198 CaCl2 Sigma-Aldrich C1016 HCl Fisher Scientific A144-212 Cycloheximide Sigma 038K1561 Carbenicillin Cellgro 46-100-RG NaCl Fisher S271-1 Na Citrate• 2H2O Fisher S279-500 глюкоза (декстроза) BD 215530 7H9 бульонная основа BD 271310 7H10 BD 262710 Glycerin Shelton IB15760 Fisher S71907 X-Gal (5-бром-4-хлор-3-индолил-β-D-галактопиранозид) Teknova X1205 Диметилформамид (DMF) Sigma D4551 Ethanol Fisher CDA19 Хлорный отбеливатель Chlorox 02490/06644884 CiDecon (дезинфицирующее средство) Decon Laboratories, Inc. 8504 Наименование оборудования Company Каталожный номер Experiment Металлические петли American Educational Products S17352 Streak plating Одноразовые пластиковые петли Fisher 22-363-602 Streak plating Деревянные палочки Fisher 23-400-104 Streak plating Плоские зубочистки American Educational Products S67859 Streak plating Поворотные столы Fisher 08-758Q Spread Plating Стеклянные стержни Bellco Glass NC9004380 Spread Plating 4 мм Fisher 11-312B Spread Plating Velveteen Bel-Art Products 09-718-2 Реплика гальванического покрытия Цилиндрический блок Bel-Art Products 09-718-1 Реплика гальванического покрытия < тело> <тр> <тр> <тр> <тр> <тр> <тр> <тр> <тр> Стеклянные шарики <тр> Вельветовая ткань <тр>