Методическая статья

Асептики лаборатории: Покрытие методы

774.7K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/3064

⸱

11 мая 2012 г.

1Microbiology, Immunology, and Molecular Genetics, University of California, Los Angeles

В этой статье

Краткое содержание

При работе со средами и реагентами, используемыми для культивирования микроорганизмов, необходимо применять асептический метод, чтобы свести к минимуму загрязнение. Для выделения, размножения или перечисления бактерий и фагов обычно используются различные методы нанесения покрытий, каждый из которых включает в себя процедуры, поддерживающие стерильность экспериментальных материалов.

Аннотация

Микроорганизмы присутствуют на всех неодушевленных поверхностях, создавая повсеместные источники возможного загрязнения в лаборатории. Успех эксперимента зависит от способности ученого стерилизовать рабочие поверхности и оборудование, а также предотвратить контакт стерильных инструментов и растворов с нестерильными поверхностями. Здесь мы представляем этапы нескольких методов нанесения покрытий, обычно используемых в лаборатории для выделения, размножения или перечисления микроорганизмов, таких как бактерии и фаги. Все пять методов включают в себя асептическую технику, или процедуры, которые поддерживают стерильность экспериментальных материалов. Описанные процедуры включают в себя: (1) нанесение полос на бактериальные культуры для выделения отдельных колоний, (2) заливку и (3) покрытие для подсчета жизнеспособных колоний бактерий, (4) наложение мягкого агара для выделения фагов и перечисления бляшек, а также (5) повторное покрытие для переноса клеток с одной пластины на другую в идентичной пространственной схеме. Эти процедуры могут быть выполнены на лабораторном стенде при условии использования непатогенных штаммов микроорганизмов (уровень биобезопасности 1, BSL-1). Если вы работаете с организмами BSL-2, то эти манипуляции должны проходить в шкафу биобезопасности. Ознакомьтесь с последней редакцией Паспорта биобезопасности в микробиологических и биомедицинских лабораториях (BMBL), а также с Паспортами безопасности материалов (MSDS) для инфекционных веществ, чтобы определить классификацию биологической опасности, а также меры предосторожности и условия локализации, необходимые для рассматриваемого микроорганизма. Штаммы бактерий и фаговые запасы могут быть получены от исследователей, компаний и коллекций, поддерживаемых определенными организациями, такими как Американская коллекция типовых культур (ATCC). Рекомендуется использовать непатогенные штаммы при изучении различных методов гальванического покрытия. Следуя процедурам, описанным в этом протоколе, студенты должны уметь:

● Выполняйте процедуры нанесения покрытий без загрязнения среды.
● Выделите одиночные колонии бактерий методом полосового покрытия.
● Используйте методы заливки и нанесения покрытия для определения концентрации бактерий><. ● Выполняйте наложения мягкого агара при работе с фагом.
● Перенос бактериальных клеток с одной пластины на другую с помощью процедуры репликации.
● Получив экспериментальную задачу, выберите подходящий способ нанесения покрытия.

Протокол

1. Подготовка безопасного и стерильного рабочего пространства

  1. Ознакомьтесь со всеми правилами лабораторной техники и мерами предосторожности при работе с микроорганизмами. Независимо от класса биологической опасности, все материалы, контактировавшие с микроорганизмами, считаются инфицированными отходами и должны пройти деконтаминацию перед утилизацией. Соблюдайте правила техники безопасности в соответствии с инструкциями отделов охраны окружающей среды и техники безопасности вашего учреждения, подготовив соответствующие контейнеры для немедленной и правильной утилизации потенциально загрязненных материалов (биологически опасных отходов).
  2. Стерилизуйте все инструменты, растворы и среды перед их использованием для процедур посева.
  3. Уберите все лишние материалы с рабочей поверхности лабораторного стола.
  4. Протрите рабочую зону дезинфицирующим средством, чтобы минимизировать возможную контаминацию.
  5. Зажгите горелку Бунзена и работайте медленно, аккуратно и обдуманно в пределах стерильной зоны, создаваемой восходящим потоком воздуха от пламени.
    • При работе с организмами уровня BSL-2 организуйте рабочее пространство в боксе биологической безопасности. Использование горелки Бунзена внутри бокса запрещено, так как тепло от пламени нарушает поток воздуха, необходимый для его функционирования.
  6. Разместите все необходимые для процедуры принадлежности на лабораторном столе рядом со стерильной зоной. Убедитесь, что все материалы правильно промаркированы. Организация рабочего пространства для максимальной эффективности и исключения лишних движений позволит минимизировать время воздействия воздушных загрязнителей на экспериментальные материалы.
    • Поместите горелку Бунзена справа от вас на столе.
    • Поместите агарные пластины или чашки Петри слева от вас.
    • Разместите клеточные культуры, пробирки, колбы и флаконы в центре стола.
    • Приоткройте крышки пробирок, колб и флаконов, чтобы их можно было легко открыть одной рукой во время последующих манипуляций.
  7. Тщательно вымойте руки с антисептическим мылом и теплой водой перед началом работы с микроорганизмами.

2. Процедура посева штрихом: изоляция бактериальных колоний методом четырех секторов

Метод посева штрихом предназначен для выделения чистых культур бактерий, или колоний, из смешанных популяций путем простого механического разделения. Одиночные колонии состоят из миллионов клеток, растущих скоплением на поверхности или внутри агарозного планшета (Рисунок 1). В отличие от отдельной клетки, колония видна невооруженным глазом. Теоретически все клетки в колонии происходят от одной бактерии, изначально помещенной на планшет, и поэтому называются клоном, или группой генетически идентичных клеток.

  • Бактерии имеют самые разные формы и размеры. Например, отдельные клетки Escherichia coli имеют палочковидную форму со средней длиной 2 μm и шириной 0,5 μm, в то время как клетки Streptococcus имеют сферическую форму со средним диаметром 1 μm. Некоторые бактерии (такие как E. coli) существуют в виде одиночных клеток, тогда как другие образуют определенные структуры объединения. Streptococcus, например, растут парами или образуют цепочки или скопления клеток. Обычно считается, что одна колония возникает из одной клетки, подвергающейся бинарному делению; однако это предположение неверно для тех бактерий, которые естественным образом существуют в виде пар, цепочек или скоплений или которые делятся иными механизмами. Кроме того, если на чашку высевают слишком много бактерий, может произойти перекрытие клеток, что увеличит вероятность того, что две или более бактерии дадут начало структуре, которая выглядит как одна колония. Чтобы избежать этих осложнений при описании или подсчете бактериальных культур, растущих на твердой среде, колонии называют колониеобразующими единицами (кое/cfu).

При использовании метода посева штрихом смесь клеток распределяют по поверхности полутвердой питательной среды на основе агара в чашке Петри таким образом, чтобы все меньшее и меньшее количество бактериальных клеток оседало в широко разнесенных точках на поверхности среды и после инкубации развивалось в колонии. Здесь будет описан квадрантный метод выделения единичных колоний из смеси клеток.

  1. Метод посева штрихом может быть выполнен с помощью ряда различных инструментов (Рисунок 2). Металлическую петлю можно использовать многократно; она применяется для посева штрихом рутинных лабораторных штаммов. В продаже имеются одноразовые пластиковые петли, которые чаще используются при работе со штаммами BSL-2 в боксе биологической безопасности. Многие исследователи предпочитают использовать одноразовые предварительно стерилизованные деревянные палочки или плоские зубочистки. Они являются недорогой альтернативой одноразовым пластиковым петлям и могут быть особенно полезны при работе с образцами из окружающей среды, например, с почвой, которая, вероятно, содержит спорообразующие бактерии.
    • Одноразовые предварительно стерилизованные палочки и зубочистки не требуют обжига на горелке Бунзена, что предотвращает ненужную аэрозолизацию спорообразующих бактерий и перекрестное загрязнение лабораторных поверхностей или агаровых пластин спорами.
  2. Маркируйте край дна (не крышку) агаровой пластины, указав как минимум ваше имя, дату, тип питательной среды и вид организма, который будет посеян на среду.
    • Перед посевом штрихом пластины должны быть полностью сухими, без конденсата на крышке, и предварительно прогреты до комнатной температуры. Если пластины хранились при 4 °C, извлеките их за несколько часов или даже за день до использования. Разложите их небольшими смещенными стопками не более чем по 2-3 пластины и дайте им высохнуть.
  3. Образец, из которого будет производиться инокуляция на пластину, может представлять собой либо суспензию клеток в бульоне, либо существующую колонию с другой агаровой пластины. В начале рекомендуется использовать только один образец для инокуляции одной пластины. Для экономии времени и материалов одну пластину можно использовать для нескольких образцов, но только после того, как вы в совершенстве освоите технику посева одного образца на пластину.
  4. Для первого квадранта образец захватывают и распределяют примерно по одной четверти поверхности среды быстрыми, плавными движениями вперед-назад (Панель A Рисунка 3). Приподнимите нижнюю часть перевернутой пластины над столом. Многократно перемещайте петлю, палочку или зубочистку вперед-назад по поверхности агара от края к центру пластины.
    • Если инокулят представляет собой суспензию клеток, возьмите одну петлю с помощью металлической петли или 5–10 μl с помощью микропипетки. Перед отбором аликвоты для посева обязательно перемешайте суспензию клеток круговыми движениями или с помощью вортекса. При выполнении этого шага соблюдайте правила асептики, обжигая не только петлю, но и горлышко флакона или пробирки до и после извлечения инокулята. Также не касайтесь стенок пробирки или флакона петлей или носиком микропипетки. При дозировании инокулята пипеткой нанесите суспензию клеток в соответствующее место на пластине, затем используйте петлю, палочку или зубочистку, чтобы распределить её по первому квадранту пластины.
    • Если инокулят представляет собой колонию с другой пластины, осторожно коснитесь колонии петлей, палочкой или зубочисткой, а затем распределите её по первому квадранту пластины. Убедитесь, что металлическая петля остыла перед касанием колонии. Чтобы убедиться, что петля не слишком горячая, слегка коснитесь агара в отведенной области, где посев производиться не будет. Из колонии требуется всего несколько клеток, а не вся колония.
    • При использовании металлической петли простерилизуйте её на горелке Бунзена перед взятием инокулята для пластины (Панель B Рисунка 3). Начните примерно в 3-4 дюймах от петли, удерживая проволоку в кончике синего конуса — самой горячей части пламени. Металл должен раскалиться докрасна. Перемещайте проволоку так, чтобы пламя приблизилось к петле. Такая манипуляция предотвращает аэрозолизацию бактерий, оставшихся на петле после предыдущего использования.
    • Обжиг убивает бактерии (хотя и не споры), а конвекционные потоки нагретого воздуха препятствуют оседанию других переносимых по воздуху загрязнителей на металлическую проволоку во время последующих манипуляций.
    • Если используется стерильная плоская зубочистка, осторожно держите её узкий конец большим и безымянным пальцами под углом 10–20° к среде и используйте широкий конец для посева квадрантов. Если используется петля или деревянная палочка, держите её как карандаш под тем же углом. Не давите слишком сильно, чтобы петля, палочка или зубочистка не врезались в агар.
  5. После завершения первого квадранта переверните пластину и поставьте её обратно на крышку на стол. Утилизируйте палочку или зубочистку или повторно обожгите металлическую петлю, как описано в шаге №4.
  6. Поверните чашку Петри на 90°, чтобы посеять второй квадрант. Приподнимите нижнюю часть перевернутой пластины над столом, затем коснитесь петлей, палочкой или зубочисткой первого квадранта рядом с концом последнего штриха. Используя паттерн движений вперед-назад, пересеките последние половину штрихов в первом квадранте, а затем перейдите в пустой второй квадрант. Как только второй квадрант будет заполнен, переверните пластину и поставьте её обратно на крышку на стол.
    • Петля, палочка или зубочистка ни в коем случае не должны возвращаться в первую половину штрихов первого квадранта, где было отложено большинство исходного инокулята.
    • Для каждого квадранта следует использовать новую пластиковую петлю, деревянную палочку или зубочистку.
  7. Повторите шаг №6 дважды для третьего и четвертого квадрантов.
    • Не забудьте утилизировать палочку или зубочистку или повторно обожчь металлическую петлю между каждым квадрантом.
    • При посеве четвертого квадранта избегайте захода в первый квадрант.
  8. Инкубируйте пластину перевернутой, чтобы конденсат, скапливающийся на крышке, не капал на колонии.

3. Метод посева путем полива: подсчет бактериальных клеток в смешанном образце

Этот метод часто используется для подсчета количества микроорганизмов в смешанном образце, который добавляют в расплавленную агаровую среду перед ее застыванием. В результате этого процесса при посеве соответствующего разведения образца колонии равномерно распределяются по всему объему твердой среды. Данная методика применяется для проведения жизнеспособного подсчета на чашках, при котором подсчитывается общее количество колониеобразующих единиц внутри агара и на его поверхности на одной чашке. Жизнеспособный подсчет на чашках предоставляет ученым стандартизированный способ построения кривых роста, расчета концентрации клеток в пробирке, из которой был отобран образец для посева, а также изучения влияния различных условий среды или условий культивирования на выживаемость или скорость роста бактериальных клеток.

  1. Подпишите бортик дна (не крышку) стерильной пустой чашки Петри, указав как минимум ваше имя, дату, тип питательной среды и вид организма, который будет добавлен в расплавленный агарозный гель.
    • Укажите коэффициент разведения, если вы выполняете посев последовательных разведений (серии повторяющихся разведений, приводящих к систематическому снижению концентрации клеток в образце). Подготовка последовательных разведений необходима, если количество клеток в образце превышает емкость агаровой пластинки, при этом статистически значимый диапазон составляет от 30 до 300 cfu. Если на пластинке окажется более 300 cfu, колонии будут расположены слишком тесно и будут перекрывать друг друга.
  2. Возьмите пробирку, содержащую 18 ml расплавленной агаровой среды.
    • Агаровая среда должна быть разливна по пробиркам и предварительно стерилизована в автоклаве. В день проведения эксперимента агар следует расплавить в стерилизаторе (пароварке) в течение 30 минут, после чего перенести в водяную баню при 55 °C. Расплавлять следует только то количество агара, которое необходимо для эксперимента, так как повторно использовать его нельзя.
    • За десять минут до разлива по чашкам пробирки с расплавленным агаром следует перенести из водяной бани при 55 °C на термоблок лабораторного стола, настроенный на 48 °C. Как только агар достигнет этой температуры, он будет готов к разливу. Если агар будет слишком горячим, бактерии в образце могут погибнуть. Если агар будет слишком холодным, после застывания среда может стать неоднородной (комковатой).
  3. Подготовьте образец, который должен представлять собой либо жидкую культуру, либо суспензию клеток, полученную путем смешивания клеток из колонии с буфером или физиологическим раствором.
    • Образцы могут быть получены из серии разведений одного исходного образца.
    • Объем образца для посева должен составлять от 0.1 до 1.0 ml.
  4. Откройте крышку пустой чашки Петри и внесите образец в центр пластинки (Панель А на Рисунке 4). Закройте крышку.
    • На протяжении всей процедуры соблюдайте правила асептики.
    • Для переноса образца на пластинку используйте серологическую пипетку или микропипетку. Контролируйте поток образца, чтобы он не выплеснулся за пределы чашки.
  5. Снимите колпачок с пробирки с расплавленным агаром и прокалите края открытой пробирки в пламени горелки Бунзена.
  6. Откройте крышку чашки Петри с образцом и осторожно залейте агар (Панель B на Рисунке 4). Закройте крышку, затем перемешайте образец с агаром, осторожно покачивая пластинку круговыми движениями.
  7. Дождитесь полного застывания агара, прежде чем перевернуть пластинку для инкубации.

4. Процедура посева методом распределения по поверхности: формирование отдельных бактериальных колоний для подсчета на чашках, обогащения, селекции или скрининга

Эта методика обычно используется для разделения микроорганизмов, содержащихся в малом объеме образца, который распределяют по поверхности агарной пластинки. При посеве соответствующей концентрации клеток это приводит к образованию отдельных колоний, равномерно распределенных по поверхности агара. Помимо использования данной методики для подсчета жизнеспособных клеток, при котором суммируется общее количество колониеобразующих единиц на одной пластинке и используется для расчета концентрации клеток в пробирке, из которой был взят образец, метод посева путем распределения по поверхности рутинно применяется в экспериментах по обогащению, селекции и скринингу. Желаемый результат для этих трех типов экспериментов обычно такой же, как и при подсчете клеток: формирование распределения отдельных колоний по поверхности агара. Однако целью здесь является не обеспечение роста всех жизнеспособных клеток. Вместо этого должны вырасти только те клетки в популяции, которые обладают определенным генотипом. Процедуру посева путем распределения по поверхности могут предпочесть методу посева в толщу агара в экспериментах по подсчету, если конечной целью является изоляция колоний для дальнейшего анализа, так как при этом колонии растут доступно на поверхности агара, тогда как при посеве в толщу они оказываются внутри агара.

Здесь описаны две стратегии выполнения процедуры посева методом распределения по поверхности. Первая (Метод А) предполагает использование поворотного столика и стеклянного или металлического стержня в форме хоккейной клюшки. Вторая (Метод Б), называемая «методом Копакабана», предполагает встряхивание предварительно стерилизованных стеклянных шариков. Оба метода способствуют равномерному распределению клеток по поверхности агара.

Метод А: Посев путем распределения с использованием поворотного столика и стеклянного или металлического стержня

  1. Промаркируйте край дна (не крышки) чашки с агаром, указав как минимум ваше имя, дату, тип питательной среды и вид организма, который будет высеваться на среду.
    • Укажите коэффициент разведения, если вы высеваете серийные разведения.
    • Перед посевом методом рассева чашки должны быть полностью сухими, без конденсата на крышке, и предварительно прогреты до комнатной температуры. Если чашки хранились при 4 °C, извлеките их за несколько часов или даже за день до использования. Разложите их небольшими смещенными стопками не более чем по 2-3 чашки и дайте им высохнуть.
  2. Центрируйте чашку на поворотном столике (Рисунок 5).
  3. Подготовьте образец, который должен представлять собой бульонную культуру или суспензию клеток, полученную путем смешивания клеток колонии с буфером или физиологическим раствором.
    • Образцы могут быть получены из серии разведений одного исходного образца.
    • Объем образца для посева должен составлять от 0.1 до 0.2 ml.
  4. Откройте крышку чашки Петри и внесите образец в центр агара. Закройте крышку.
    • На протяжении всей процедуры соблюдайте правила асептики.
    • Для переноса образца в чашку используйте микропипетку. Контролируйте поток образца, чтобы он не выплеснулся за пределы чашки.
  5. Окуните стеклянный или металлический стержень (также называемый шпателем или рассадочной петлей) в стакан с 70% (v/v) этанолом.
    • ОСТОРОЖНО: Никогда не окунайте горячий шпатель в стакан со спиртом.
    • Этанол должен касаться только нижней части шпателя и первого дюйма стержня.
  6. Слейте излишки этанола и подожгите их, пронеся шпатель через пламя горелки Бунзена.
    • Пламя должно пройти по всей длине шпателя и стержня, которые контактировали с этанолом, а затем быстро погаснуть.
    • Если этанол в стакане вспыхнет, не паникуйте! Накройте стакан стеклянной крышкой, что быстро погасит огонь.
  7. Откройте крышку чашки с агаром, удерживая её в левой руке большим и указательным пальцами. Охладите шпатель, прикоснувшись им к агару вдоль края у бортика.
    • Не касайтесь агара в том месте, куда был внесен образец. Горячий шпатель убьет клетки.
  8. Медленно вращайте поворотный столик левой рукой (продолжая удерживать крышку чашки с агаром).
    • Хотя этого следует избегать, если вам необходимо положить крышку, положите её внутренней стороной вниз на дезинфицированную поверхность в пределах стерильной зоны горелки Бунзена. Если положить крышку внутренней стороной вверх, возрастает вероятность контаминации из-за движения предметов или рук, создающих потоки воздуха, которые способствуют оседанию микроорганизмов и частиц пыли на внутреннюю поверхность крышки.
  9. Правой рукой аккуратно прижмите шпатель к поверхности агара и постепенно равномерно распределите образец по всей площади чашки. Перемещайте шпатель вперед-назад по чашке по мере вращения поворотного столика.
  10. Дайте образцу полностью впитаться (минимум 5 минут), прежде чем перевернуть чашку для инкубации.

Метод B: Посев методом распределения с использованием стеклянных шариков: «метод Копакабана»

  1. Подпишите дно (не крышку) чашки с агаром по краю, указав как минимум свое имя, дату, тип питательной среды и вид организма, который будет высеян на среду.
    • При посеве серийных разведений укажите коэффициент разведения.
  2. Откройте крышку чашки с агаром, удерживая ее в левой руке большим и указательным пальцами. Затем откройте стеклянную пробирку или флакон с предварительно стерилизованными стеклянными шариками. Правой рукой прокалите горлышко пробирки или флакона, затем осторожно высыпьте 10–12 стерильных стеклянных шариков в чашку с агаром (Рисунок 6). Закройте крышку чашки и снова прокалите горлышко пробирки или флакона, прежде чем закрыть его пробкой и отставить в сторону.
    • Осторожно высыпайте шарики из пробирки или флакона на высоте нескольких сантиметров над агаром, чтобы они не выпрыгнули из чашки Петри.
    • Используйте стеклянные шарики диаметром 4 mm. Стерилизуйте их в стеклянных флаконах или пробирках в автоклаве при 121 °C в режиме сушки (гравитационный цикл) в течение 30 минут.
    • Одним из преимуществ использования шариков вместо шпателя является отсутствие необходимости в открытых емкостях с этанолом для повторного прокаливания.
  3. Откройте крышку чашки с агаром и нанесите образец в центр агара. Закройте крышку.
    • На протяжении всей процедуры соблюдайте правила асептики.
    • Вносите аликвоту образца объемом от 100 до 150 μl на одну чашку. Такой объем обеспечит равномерное распределение клеток. Для переноса образца в чашку используйте микропипетку. Контролируйте поток образца, чтобы он не разбрызгался за пределы чашки.
  4. Распределите образец, осторожно встряхивая шарики по поверхности агара 6–7 раз. Для равномерного распределения клеток используйте горизонтальные движения.
    • Не вращайте шарики по кругу, иначе все клетки окажутся у края чашки.
    • СОВЕТ: При правильном выполнении процедура напоминает «звук маракасов».
  5. Поверните чашку на 60° и снова встряхните горизонтально 6–7 раз.
  6. Поверните чашку на 60° второй раз и снова встряхните горизонтально. К этому моменту клетки должны равномерно распределиться по поверхности агара.
  7. По завершении посева образец должен впитаться, а поверхность агара стать сухой. Слейте загрязненные шарики в маркированный сборный стакан с 10% раствором хлорного отбеливателя.
    • Не выбрасывайте шарики в мусор! Использованные шарики будут промыты и автоклавированы для повторной стерилизации и последующего использования.
    • ПРИМЕЧАНИЕ: Если после трехкратного встряхивания поверхность агара все еще влажная, оставьте чашку на несколько минут, чтобы жидкость впиталась в агар, затем повторите шаги №4–6, пока поверхность чашки не станет сухой.
  8. Переверните чашку для инкубации.

5. Процедура с мягким агаровым слоем: формирование бляшек для изоляции и подсчета фагов (метод агаровых слоев)

Этот метод обычно используется для обнаружения и количественного определения бактериофагов (фагов), или бактериальных вирусов, размер которых варьирует от 100 до 200 нм. Для визуализации отдельных частиц фага требуется электронный микроскоп. Однако наличие инфекционных частиц фага можно обнаружить как бляшки в чашке с агаром (Рисунок 7A). Фаги не могут реплицироваться вне бактериальных клеток-хозяев, поэтому для их размножения и обнаружения требуется смешивание фагов и клеток-хозяев перед посевом на чашки. Для процедуры наслоения мягкого агара используется небольшой объем, как правило, в диапазоне от 50 μl в / к / до 200 μl, суспензии фагов дозируют в пробирку, содержащую около 108 бактерии (клетки-хозяева), равномерно распределенные в 2,5–3,0 мл расплавленного мягкого (0,5–0,7% [масс./об.]) питательного агара. Полученную смесь выливают на поверхность чашки с твердым (1,5–1,9% [масс./об.]) питательным агаром. Чашку достаточно покачивают, чтобы мягкий агар полностью покрыл поверхность твердого агара. Затем чашку помещают на ровную поверхность до застывания верхнего слоя агара, после чего ее можно перенести в инкубатор.

Со временем в мягком агаре становится видна мутная суспензия бактериальных клеток, называемая бактериальным газоном (Рисунок 7B). Бляшки образуются, если фаг заражает одну из бактериальных клеток, реплицируется внутри нее, а затем вызывает лизис клетки, высвобождая до 100 дочерних фагов (так называемый размер выхода). Новые частицы фага диффундируют в мягкий агар, заражая бактерии в области вокруг лизированной бактериальной клетки. После нескольких циклов инфекции и лизиса мутная суспензия бактериальных клеток в мягком агаре исчезает, оставляя зону просветления, называемую бляшкой. Каждая бляшка содержит более 109 частиц фага, которые генетически идентичны исходной инфекционной частице фага. Поскольку бляшка возникает из одной частицы фага, можно подсчитать итоговое количество бляшкообразующих единиц (БОЕ) и рассчитать исходную концентрацию, или титр, суспензии фага. Этот тип эксперимента, называемый методом определения титра фага по бляшкам, также предоставляет ученым стандартизированный способ построения кривых одноступенчатого роста, исследования специфичности спектра хозяев и трансдукции бактериальных клеток для генетических экспериментов.

  1. Подготовьте индикаторные бактерии: Для проведения эксперимента с наложением мягкого агара необходимо подготовить культуру бактериального штамма-хозяина, находящуюся в фазе экспоненциального роста. Каждый штамм-хозяин имеет свои собственные требования к условиям культивирования. Для каждой чашки требуется от 0,3 до 0,5 мл суспензии индикаторных бактерий. Если подготовлена колба с индикаторными бактериями (например, 25 мл), культуру следует разделить на более мелкие аликвоты (например, аликвоты по 5 мл, разлитые в стерильные пробирки с завинчивающимися крышками), чтобы минимизировать возможность перекрестного загрязнения. Пробирки можно хранить на льду (при 4 °C) до начала использования в эксперименте. С помощью асептических методов инокулируйте стерильный питательный бульон, затем проведите инкубацию в соответствии со спецификациями бактериального штамма. Остатки культур следует утилизировать в конце рабочего дня.
  2. Подготовьте адсорбционные трубки: Поместите две стерильные микроцентрифужные пробирки в штатив. На крышке первой пробирки сделайте надпись «Фаг», а на крышке второй — «Контроль».
    • Как правило, серийные разведения в случае приготовления и высева фаговых лизатов в стойку добавляются дополнительные микроцентрифужные пробирки, на которых указывается коэффициент разведения.
    • Запасы фагов следует готовить свежими из одиночных бляшек и хранить при 4 °CДля дезагрегации частиц фага перед проведением эксперимента стоки следует довести до комнатной температуры.
    • С запасами фагов следует обращаться осторожно: не используйте вортекс и не переносите их пипеткой слишком интенсивно.
  3. Добавить 50 μl образца фага в первую пробирку, затем добавьте 50 μl фагового буфера во вторую пробирку, которая будет служить отрицательным контролем для анализа по методу агаровых слоев.
    • При всех манипуляциях с фагами и бактериями следует соблюдать правила асептики.
  4. Далее добавьте 500 μl индикаторных бактерий в каждую адсорбционную трубку.
    • Бактериальные клетки оседают на дно пробирки при длительном нахождении на льду или на рабочем столе. Если культура не будет перемешана перед отбором аликвоты для эксперимента, в адсорбционную пробирку будет перенесено недостаточное количество бактериальных клеток. Для обнаружения бляшек в мягком агаре должно образоваться достаточное количество бактериальных колоний (т. е. сплошной газон). Перед переносом аликвот в адсорбционные пробирки используйте вортекс для осторожного ресуспендирования индикаторных бактерий до получения гомогенной суспензии.
  5. Смешайте бактериальные клетки и фаги, осторожно постукивая по пробиркам.
  6. Инкубируйте смесь фага и бактерий в течение 15–20 минут (но не более 30 минут) при температуре, соответствующей условиям культивирования индикаторного штамма.
  7. Приготовьте чашки с питательным мягким и твердым агаром: Во время адсорбции поместите две пробирки с мягким агаром (предварительно расплавленным и хранившимся при 55 °C) в нагревательном блоке на лабораторном столе, установленном на 46-48 °C.
    • Расплавленный мягкий агар необходимо выдерживать при температуре нагревательного блока в течение 10–15 минут для уравновешивания температуры. Если расплавленный мягкий агар будет находиться в таком состоянии более 15 минут, он начнет затвердевать, что приведет к образованию комков при выливании на твердый агар. Если же время выдержки составит менее 10 минут, агар будет слишком горячим при добавлении в смесь фагов и бактерий, что приведет к гибели клеток-хозяев до посева на чашки. В результате бактериальный газон может не сформироваться, и бляшки будут обнаруживаться редко или отсутствовать вовсе.
    • Подготовьте дополнительные пробирки с мягким агаром, если планируется посев серийных разведений лизата фага.
  8. Промаркируйте по краю дна (не крышки) двух чашек с питательным твердым агаром, указав как минимум ваше имя, дату, тип питательной среды, а также надпись «Фаг» или «Контроль» в соответствии с пробирками для адсорбции.
    • При посеве серийных разведений используйте дополнительные чашки, помеченные с указанием коэффициента разведения.
    • Чашки с твердым агаром должны быть полностью сухими, без конденсата на крышке, и предварительно прогреты до комнатной температуры перед добавлением мягкого агара. Если чашки хранятся при 4 °Cснимите их за несколько часов или даже за день до начала работы. Разложите их небольшими ступенчатыми стопками не более 2-3 чашек и дайте им высохнуть. Избыточная влага в слое твердого агара приведет к разбавлению мягкого агара, что облегчит диффузию фагов через мягкий агар в процессе формирования бляшек. Как следствие, размер бляшек увеличится.
  9. Поочередно заполняйте адсорбционные трубки на планшете следующим образом: С помощью микропипетки P1000 в асептических условиях перенесите смесь фагов и бактерий (объем должен составлять примерно 550 μl) в пробирку с мягким агаром, затем быстро вращайте ее между ладонями для перемешивания содержимого. НЕ встряхивайте пробирку, чтобы избежать появления пузырьков воздуха. Держа пробирку в левой руке, правой рукой откройте крышку чашки с твердым агаром и незамедлительно вылейте все содержимое пробирки на поверхность плотной агаровой среды. Перед тем как закрыть крышку, осторожно, но быстро покачайте чашку, чтобы распределить расплавленный мягкий агар по всей поверхности среды до того, как он успеет затвердеть. Избегайте попадания расплавленного мягкого агара на стенки чашки Петри. Закройте крышку.
  10. Повторите шаг №9 для всех адсорбционных трубок, одна пробирка за один раз.
  11. Поместите чашки на ровную поверхность и оставьте их в покое до полного затвердевания мягкого агара.
    • Как правило, 30 минут достаточно.
  12. Переверните планшеты для инкубации.
    • Несколько планшетов можно сложить стопкой, зафиксировать их лентой, после чего перевернуть для инкубации.

После инкубации чашки можно осмотреть на наличие бляшек. В отрицательном контроле должен быть только сплошной бактериальный газон (без отверстий, указывающих на наличие бляшек). Бляшки различаются по размеру, форме и общему виду. Конкретный тип фага можно выделить из гетерогенной смеси бляшек, осторожно прокалывая центр одной бляшки стерильной зубочисткой и перенося инокулят в стерильную микроцентрифужную пробирку, содержащую от 100 до 1000 μl бульона или фагового буфера. Полученный лизат можно посеять на чашки, используя ту же процедуру, которая была описана выше. Для обеспечения чистоты выделенного фага необходимо провести как минимум от 3 до 6 последовательных изоляций из единичных бляшек. Часто лизат приходится разводить в широком диапазоне (от 10-1 до 10-10), чтобы подобрать титр, при котором на чашке образуются неперекрывающиеся бляшки. Это число варьируется в зависимости от размера бляшки.

6. Процедура приготовления репликационных планшетов: перенос клеток для скрининга мутантов и ауксотрофов

Данный метод позволяет сравнивать рост клеток на первичной чашке с их ростом на вторичных чашках, что дает возможность проводить скрининг клеток на наличие определенного селективного фенотипа. Сначала на первичную, или мастер-пластину, высевают клетки либо путем посева разведения, обеспечивающего образование одиночных колоний, либо путем переноса клеток на чашку в пространственном порядке, заданном разметкой сетки. Вторичные чашки, содержащие среды с ингибиторами роста или среды с дефицитом определенного питательного вещества, инокулируют клетками из колоний с первичной чашки. Пространственный порядок расположения колоний воспроизводят, прижимая кусочек бархата к первичной чашке. Бактериальные клетки прилипают к бархату, поскольку обладают большим сродством к нему, чем к агару. Затем отпечаток клеток на бархате переносят на несколько вторичных чашек, при этом рост клеток отражает тот же порядок расположения колоний, что и на первичной чашке. Иными словами, это работает по принципу резинового штампа, копирующего схему роста с одной чашки на другую. Данный метод преимуществен тем, что он позволяет одновременно скринировать относительно большое количество колоний на наличие многих фенотипов в рамках одного эксперимента.

  1. Подготовка первичной чашки: Нанесите маркировку по краю дна (не на крышку) агарной чашки, указав как минимум ваше имя, дату и тип питательной среды.
  2. Нанесите на дно чашки сетку, состоящую как минимум из двух равноудаленных вертикальных и двух равноудаленных горизонтальных линий. Пронумеруйте получившиеся квадраты.
  3. С помощью предварительно стерилизованной зубочистки инокулируйте каждый квадрат образцом клеток. Для каждого образца сделайте касание в центре квадрата. Не заполняйте клеткими весь квадрат (Рисунок 8), иначе при инкубации образец разрастется и контаминирует соседние квадраты.
    • Каждый квадрат инокулируют разным образцом, полученным либо из бульонных культур, либо из колоний на другой чашке.
  4. Переверните и инкубируйте первичную чашку, которая будет использоваться для инокуляции различных вторичных сред.
  5. Инокуляция вторичных чашек: Сложите стопкой первичную чашку и все вторичные чашки. Маркером нанесите метку ориентации на боковую поверхность чашек. Убедитесь, что метка находится на нижней части каждой чашки, а не на крышке.
  6. Возьмите стерильный вельветовый лоскут и поместите его на цилиндрический блок (Рисунок 9). Зафиксируйте вельветовый лоскут с помощью держателя. Обратите внимание на метку ориентации на блоке.
    • Блок должен быть того же размера, что и дно чашки Петри (диаметром 10.2 cm). Он должен быть оснащен фиксирующим кольцом, которое прижимает вельветовую ткань к блоку во время репликации посева.
    • Вельветовый лоскут (квадрат 15.2 x 15.2 cm) должен быть предварительно стерилизован. Сложите стопкой 10 или 12 чистых квадратов, заверните их в алюминиевую фольгу и поместите в автоклав при 121 °C в режиме сушки (гравитационный цикл) на 30 минут. Перед использованием в эксперименте по репликации посева убедитесь, что они полностью высохли, выдержав их в теплом шкафу в течение нескольких часов. Обратите внимание, что перед стерилизацией с вельветовых квадратов может потребоваться удалить ворс с помощью малярного скотча.
    • Вельветовые квадраты можно использовать повторно. После деконтаминации использованных вельветовых квадратов в автоклаве их следует промыть проточной водой и повторно стерилизовать, как описано выше.
    • Цилиндрический блок и зажим следует дезинфицировать между использованиями путем кратковременного промывания 70% (v/v) этанолом или 10% раствором хлорного отбеливателя.
  7. Снимите крышку и переверните первичную чашку. Совместите метку ориентации на чашке с меткой на блоке. Опустите чашку так, чтобы поверхность агара соприкоснулась с вельветовым лоскутом на цилиндрическом блоке. Слегка, но равномерно нажмите кончиками пальцев на заднюю сторону первичной чашки, а затем осторожно поднимите первичную чашку от блока. Закройте чашку крышкой.
    • Вельветового отпечатка клеток с первичной чашки достаточно для инокуляции примерно 7-8 вторичных чашек, прежде чем потребуется сделать новый отпечаток с новым лоскутом вельвета.
  8. Повторите шаг №7 для каждой из вторичных чашек.
    • В качестве положительного контроля последняя чашка в серии должна содержать агаровую среду, на которой должны расти все тестируемые штаммы. Таким образом можно подтвердить, что клетки были перенесены на все вторичные чашки в серии. В противном случае отсутствие роста на конкретной тестовой среде может быть приписано недостаточному переносу клеток, а не фенотипу штамма.
    • Во избежание ложноположительных результатов вторичные чашки следует располагать в порядке от наименее к наиболее благоприятному субстрату. В противном случае питательные вещества могут переноситься между чашками, что позволит клеткам расти на неблагоприятной среде.
  9. Переверните чашки и инкубируйте.
    • Примечание: При проверке вторичных чашек на наличие роста обязательно отличайте фактический рост от отпечатка. Последний является отрицательным результатом.

7. Очистка рабочего пространства

  1. Выключите горелку Бунзена, затем уберите все материалы, включая культуры на чашках или в пробирках, избыток среды и другие реагенты.
    • Не допускайте скопления старых культур, как на чашках, так и в пробирках, на лабораторном столе или в местах хранения. Эти образцы, являющиеся известными источниками контаминации, такой как плесень и нежелательные виды бактерий, следует утилизировать сразу после того, как они перестанут быть необходимыми.
  2. Поместите загрязненные лабораторные принадлежности (перчатки, наконечники для пипеток, салфетки Kimwipes), стеклянную посуду (пробирки, колбы, флаконы) и опасные отходы (бактериальные культуры или растворы фагов, использованные чашки) в соответствующий контейнер для утилизации. При работе с непатогенным штаммом E. coli (BSL-1) образуются только неинфекционные опасные отходы. При выполнении тех же процедур с патогенными организмами (BSL-2 и выше) образуются инфекционные опасные отходы. Независимо от классификации биологической опасности, опасные отходы перед утилизацией должны быть автоклавированы или продезинфицированы. Следуйте рекомендациям, изложенным в BMBL (5th Ed.), а также правилам вашего институционального отдела охраны окружающей среды и техники безопасности по незамедлительной и надлежащей утилизации биоопасных материалов, образовавшихся в ходе эксперимента.
  3. Протрите рабочую зону дезинфицирующим средством.
  4. Перед выходом из лаборатории тщательно вымойте руки с антисептическим мылом и теплой водой.

8. Репрезентативные результаты

Метод посева штрихом. Пример нанесения образца при посеве штрихом показан на Рисунке 1. Эта процедура используется для изолирования бактериальных колоний из смешанных культур клеток и является одной из самых важных техник в микробиологии и молекулярной генетике. Каждая колония представляет собой популяцию генетически идентичных клеток. Для многих последующих приложений крайне важно начинать либо с одной колонии, либо с чистой бактериальной культуры, полученной путем инокуляции среды клетками из одной колонии. Например, морфологию отдельных клеток внутри колонии можно изучить с помощью светового микроскопа. Генетическая идентичность может быть определена путем секвенирования гена малой субъединицы рибосомной РНК из геномной ДНК, выделенной из клеточной культуры, созданной на основе одной колонии. А метаболические характеристики можно описать, подвергнув клетки различным биохимическим и физиологическим тестам. Только при проведении таких экспериментов с чистыми культурами можно быть уверенным в свойствах, приписываемых конкретному микроорганизму. Результаты не будут искажены из-за возможного загрязнения культуры. Технические ошибки могут возникнуть, если стерильность инструмента, используемого для распределения клеток по поверхности чашки, не будет поддерживаться на протяжении всей процедуры. Если забыть простерилизовать петлю в пламени или взять новую зубочистку между квадрантами, получить отдельные колонии будет затруднительно. Некоторые виды бактерий не могут быть выделены в чистую культуру, так как для определенных требований к росту они зависят от кооперативной ассоциации с другим видом бактерий. Такие организмы, называемые синтрофами, могут расти только в условиях совместного культивирования, поэтому колонии (если они образуются) всегда будут состоять из двух или более видов. Еще одной проблемой, возникающей в лаборатории при выполнении посева штрихом бактерий, полученных из образцов окружающей среды, является то, что клетки проявляют характеристики роста, отличающиеся от традиционных лабораторных штаммов, таких как E. coli. Такие бактериальные штаммы могут образовывать колонии, которые являются нитевидными (в отличие от плотных скоплений клеток) с ветвями, распространяющимися на большую часть агаровой чашки, кальцинированными и, следовательно, устойчивыми к проникновению инструмента для посева, или окруженными липкой капсулой, из-за чего отдельные колонии невозможно различить. Эти характеристики затрудняют очистку одиночных колоний методом посева штрихом.

Метод посева в глубокий слой агара. При использовании метода посева в глубокий слой агара колонии образуются как внутри агара, так и на поверхности агаровой среды, что обеспечивает удобный способ подсчета количества жизнеспособных клеток в образце. Эта процедура применяется в различных областях промышленности. Например, для очистных сооружений, отвечающих за очистку жидких отходов (например, сточных вод, стоков из ливневых канализацияций), образующихся в результате бытовой, коммерческой и промышленной деятельности, а также в сельском хозяйстве, крайне важно анализировать пробы воды после процесса глубокой очистки. Очищенные сточные воды (непитьевая вода) используются повторно различными способами — для орошения непищевых культур в сельском хозяйстве, для санитарного слива в жилых помещениях и в промышленных градирнях, поэтому они должны быть очищены от химического и микробиологического загрязнения. Питьевая вода должна очищаться в соответствии со стандартами EPA и проверяться с помощью микробиологических методов посева, которые позволяют подсчитать количество конкретных патогенов человека. На рисунке 10 показаны бактериальные колонии, образовавшиеся из бактериальных клеток, присутствовавших в пробе воды, взятой из общественного питьевого фонтана. Маловероятно, что эти колонии были образованы бактериальными патогенами, учитывая меры очистки питьевой воды; тем не менее, микробы повсеместны, и загрязнение даже непатогенными штаммами можно лишь минимизировать, но не устранить полностью. В качестве другого примера: фармацевтической компании необходимо оценить степень микробиологического загрязнения, или бионагрузку, нового лекарственного препарата в процессе производства, хранения и транспортировки. Путем отбора проб препарата на различных этапах процесса и посева образцов методом посева в глубокий слой агара можно легко определить микробную нагрузку, то есть количество contaminating bacteria. Затем можно разработать меры предосторожности для минимизации или устранения микробиологического загрязнения. Одной из наиболее распространенных технических ошибок при выполнении метода посева в глубокий слой агара является недостаточное перемешивание образца с расплавленным агаром, что приводит к слипанию колоний и, следовательно, к неточности подсчета на чашках. Другой частой ошибкой является разливание расплавленного агара, когда он слишком горячий, что приводит к гибели многих бактериальных клеток в образце. Эта ошибка также повлияет на точность подсчета, давая значения, которые занижают общее количество колониеобразующих единиц в образце.

Метод посева путем распределения по поверхности. Метод посева путем распределения по поверхности аналогичен методу посева в массив агара по своему назначению как способа подсчета жизнеспособных клеток. Однако, поскольку колонии, образующиеся при использовании метода распределения по поверхности, равномерно распределены по поверхности агаризованной среды, клетки из отдельных колоний можно изолировать и использовать в последующих экспериментальных манипуляциях (например, в качестве инокулята для посева штрихом или для создания бульонной культуры). Три распространенных области применения, в которых метод распределения по поверхности является важным компонентом, — это эксперименты по обогащению, селекции и скринингу. Во всех трех случаях искомый тип клеток можно отделить от смеси и впоследствии подвергнуть любому количеству биохимических, физиологических или генетических тестов.

Эксперимент по обогащению предполагает посев смешанной культуры на среду или инкубацию планшетов в условиях окружающей среды, которые благоприятствуют росту тех микроорганизмов в образце, которые проявляют искомые метаболические свойства, характеристики роста или поведение. Эта стратегия не подавляет рост других организмов, но приводит к увеличению числа искомых микроорганизмов по сравнению с остальными в культуре. Таким образом, колонии, образующиеся на чашке с обогащающей средой, вероятно, обладают фенотипическими свойствами, отражающими искомый генотип. Например, если вашей целью является культивирование азотфиксирующих бактерий из образца окружающей среды, содержащего смесь более 1000 различных видов бактерий, то посев образца на среду, дефицитную по азоту, приведет к обогащению теми бактериями, которые способны вырабатывать это соединение из атмосферы, используя метаболические возможности, обеспечиваемые набором генов, необходимых для фиксации азота.

Эксперимент по селекции предполагает высев смешанной культуры на среду, на которой могут расти только те клетки, которые содержат определенный ген или набор генов. Такой тип эксперимента часто применяется в лабораториях молекулярной биологии при трансформации бактериальных штаммов плазмидами, содержащими гены устойчивости к антибиотикам. Если ваша цель — культивировать только рекомбинантные клетки (те, что успешно поглотили плазмиду), то высев образца на среду с соответствующей концентрацией антибиотика позволит отобрать клетки, проявляющие устойчивость к данному препарату.

Скрининговый эксперимент предполагает высев смешанной культуры на среду, которая позволяет расти всем жизнеспособным клеткам; при этом клетки с искомым генотипом можно отличить от остальных клеток по их фенотипу. Подобный тип экспериментов часто проводится в лабораториях молекулярной биологии при анализе мутагенеза или клонировании генов в плазмиды. Классический пример, показанный на рисунке 11, основан на использовании гена lacZ, кодирующего β-галактозидазу; этот фермент позволяет клеткам метаболизировать X-Gal (5-бром-4-хлор-3-индолил-β-D-галактопиранозид), который является аналогом его природного субстрата — лактозы. Расщепление X-Gal β-галактозидазой приводит к образованию нерастворимого синего продукта. Таким образом, если среда содержит X-gal, и на нее высевают образец, содержащий клетки либо с диким (функциональным), либо с мутантным (нефункциональным) геном lacZ, то после инкубации клетки дикого типа с функциональным геном lacZ будут выглядеть как синие колонии, а мутантные клетки с нефункциональным геном lacZ — как беспигментные («белые») колонии.

Техническая проблема, с которой чаще всего сталкиваются при первом изучении метода посева штрихом (метод распределения по поверхности), — это неравномерное распределение клеток по поверхности агара. При использовании поворотного столика и стеклянного стержня образец может впитываться слишком быстро, из-за чего колонии образуются только в центре чашки. При использовании «метода Копакабана» стеклянные бусины скорее вращают, чем встряхивают по поверхности агара. В результате многие колонии вырастают вдоль внешнего края чашки. В обоих случаях полученное распределение колоний не использует всю доступную площадь поверхности, поэтому клетки могут слипаться и вырастать в перекрывающиеся колонии, что делает подсчет колоний неточным, а различение типов клеток невозможным.

Метод мягкого агарового слоя. Для подсчета количества фагов можно использовать процедуру, аналогичную методу посева бактерий на чашки с разбавлением. В то время как для подсчета бактериальных колоний (кое/мл) на поверхность агара высевают от 30 до 300 бактериальных клеток, для подсчета бляшек (поф/мл) от 100 до 400 инфекционных частиц фага смешивают с 108–109 клеток-хозяев в слое мягкого агара, распределенного по поверхности твердого питательного агара. Если не доказано иное, обычно предполагается, что одна бактериальная клетка делится и образует большое количество генетически идентичных клеток в одном скоплении, называемом колонией. Как обсуждалось ранее, это предположение неверно, когда клетки растут группами (т. е. парами, тетрадами, цепочками или гроздьями) или обладают такими характеристиками роста, как капсулы, которые препятствуют формированию одиночных колоний. Аналогичное предположение делается и для формирования бляшек: считается, что каждая бляшка представляет собой результат активности одного фага. Это утверждение верно только в том случае, если один фаг заражает одну бактерию. Что происходит, если несколько частиц фага заражают одну бактерию? Эта проблема связана с важным статистическим параметром, который необходимо учитывать при проведении экспериментов с фагами — множественностью заражения (MOI), описывающей соотношение инфекционных частиц фага к количеству клеток-хозяев в образце. Поскольку некоторые клетки адсорбируют более одного фага, в то время как другие адсорбируют только один или не адсорбируют вовсе, популяцию клеток-хозяев следует заражать при низкой MOI (≤1), чтобы минимизировать вероятность заражения клетки более чем одной частицей фага. Использование понятия бляшкообразующей единицы (поф) в качестве функционального определения позволяет избежать этих осложнений при подсчете бляшек для расчета титра стока фага.

Как показано на Рисунке 12, морфология бляшек варьируется для разных фагов. Некоторые фаги образуют мелкие бляшки (панель A), в то время как другие дают крупные бляшки (панель B). На размер бляшек влияет ряд переменных. Существуют технические причины, способствующие этой вариабельности. Например, полные среды и толстый твердый агар способствуют развитию более крупных бляшек, так как клетки-хозяева могут поддерживать рост фагов в течение более длительного времени. Высокая плотность высева клеток-хозяев (>109 cfu на чашку) приведет к уменьшению размера бляшек. Использование более низких концентраций мягкого агара увеличит скорость диффузии фаговых частиц в мягком агаре и, следовательно, увеличит размер бляшек. Следует помнить, что такая повышенная скорость диффузии может возникнуть непреднамеренно, если чашки с твердым агаром не полностью высохли, в результате чего конденсат или избыточная влага в чашке разбавляют мягкий агар в верхнем слое. Эта техническая ошибка приведет к противоречивым результатам в отношении размера бляшек для конкретного фага.

Размер бляшки также зависит от ряда процессов в клетке-хозяине, включая эффективность адсорбции, продолжительность латентного периода (промежуток времени от адсорбции фага до лизиса клетки-хозяина) и размер burst (количество потомства, высвобождаемого при одной инфекции). Гетерогенная смесь бляшек разных размеров может наблюдаться, если частицы фага инфицируют клетки-хозяева на разных фазах бактериального роста. Например, те, которые адсорбируются в начале экспоненциальной фазы, образуют более крупные бляшки с бóльшим количеством потомственных фагов, чем те, что адсорбируются в конце экспоненциальной фазы. Как общее правило, литические фаги образуют прозрачные бляшки, тогда как лизогенные фаги формируют мутные бляшки. Однако некоторые литические фаги создают интересные структуры, такие как бляшка типа «бычий глаз», показанная на Рисунке 12B. Такие прозрачные бляшки окружены мутным гало, поскольку клетки по краю бляшки подвергаются неполному лизису или могут быть устойчивы к инфекции фагом. Рисунок «бычий глаз», наблюдаемый у умеренных фагов, представляет собой бляшку с мутным центром, окруженную прозрачным кольцом. Такая морфология отражает MOI и физиологическое состояние клетки-хозяина в контексте выбора между лизисом и лизогенией. Когда клетки впервые инфицируются фагом, MOI низкий, и клетки растут быстро из-за обилия питательных веществ; в совокупности это способствует литическому росту. По мере лизиса все большего количества клеток MOI увеличивается, и формируется прозрачная бляшка. Однако лизогены в центре бляшки продолжают расти, так как они иммунны к лизису, что приводит к образованию прозрачной бляшки с мутным центром.

Метод наложения можно модифицировать для проведения анализа бляшек с эукариотическими вирусами. Подобно тому как бактериофаги образуют бляшки на газоне бактериальных клеток в мягком агаре, эукариотические вирусы образуют бляшки на монослое клеток, покрытом гелем. Монослой представляет собой слитный пласт клеток, растущих бок о бок на поверхности чашки для культивирования, которые соприкасаются друг с другом, но не растут друг на друге. Для проведения данного типа анализа бляшек аликвоты вируса добавляют к восприимчивым монослоям эукариотических клеток. Затем монослой покрывают питательной средой на основе агарозы — этот гель ограничивает распространение дочерних вирусов, высвобождающихся из инфицированных клеток, на соседние клетки монослоя. В результате образуется сферическая область, или бляшка, содержащая клетки, поврежденные в результате высвобождения вирионов. Для облегчения визуализации бляшек могут быть использованы красители, окрашивающие живые клетки, что обеспечивает контраст между инфицированными и неинфицированными клетками.

Метод мягкого агарового слоя используется в экспериментах, помимо определения титра фагов (плак-анализа). Во-первых, важно помнить, что плотный питательный агар служит поддерживающей матрицей, обеспечивающей рост бактерий. Во-вторых, мягкий агар, используемый для создания слоя, может иметь иной нутриентный состав, чем плотный агар. Таким образом, мягкий агар может служить инструментом для анализа бактериальных штаммов на наличие различных характеристик роста или метаболических свойств. Например, метод наслоения используется для скрининга бактерий на способность разлагать целлюлозу (Teather and Wood 1982). Одиночные колонии выращивают на неселективной плотной агаровой среде, после чего на поверхность плотного агара распределяют мягкий агар, содержащий 0.1% (w/v) карбоксиметилцеллюлозы (CMC). После инкубации чашки заливают красителем, который позволяет визуализировать зоны просветления вокруг колоний в мягком агаре. Просветление возникает из-за секретируемых бактериями гидролитических ферментов, расщепляющих целлюлозу в среде. В последнее время метод наслоения применяли для обнаружения бактерий, подавляющих рост метаногенных Archaea, обитающих в рубце домашнего скота (Gilbert et al. 2010). Изоляты бактерий из проб окружающей среды выращивают на плотной питательной агаровой среде, затем колонии перекрывают слоем мягкого агара, содержащего культуру метаногенов. После инкубации чашки осматривают на наличие зон ингибирования роста вокруг колоний. Этот метод позволяет идентифицировать бактериальные штаммы, вырабатывающие ингибиторы метаногенов в мягком агаре.

Наиболее распространенными техническими ошибками при использовании метода мягкого агарового слоя являются разливание расплавленного мягкого агара при слишком высокой или слишком низкой температуре. Если агар будет слишком горячим, бактериальные клетки, смешанные со средой, погибнут до посева на чашку. Если же агар будет слишком холодным, то при разливании на твердый агар он будет образовывать комки. В обоих случаях результаты будут неоднозначными или, в лучшем случае, нечитаемыми.

Процедура репликационного посева. Перенос культур с одного типа питательной среды на другой для проверки требований к росту становится весьма трудоемким процессом, если количество штаммов превышает несколько единиц. Репликационный посев — это метод, позволяющий проводить одновременный скрининг большого количества микроорганизмов. Например, после мутагенеза культуры клеток дикого типа можно сделать разведения культуры методом посева по поверхности, чтобы получить чашки с одиночными колониями. Первичные чашки содержат среду, поддерживающую рост всех клеток, включая прототрофы дикого типа, которые синтезируют все соединения, необходимые для роста, и мутантные ауксотрофы, имеющие генетическую мутацию в биосинтетическом пути, что делает их неспособными синтезировать определенные соединения, необходимые для роста. При посеве смеси клеток на полную среду недостающие питательные вещества могут поглощаться из окружающей среды. Чтобы отличить прототрофы от ауксотрофов, колонии можно перенести репликационным методом на минимальную среду. Расти смогут только прототрофы. Поскольку пространственное расположение колоний на первичной чашке сохраняется, сравнение вторичной чашки с первичной позволяет идентифицировать мутантные колонии. Чтобы определить, какое соединение мутанты больше не способны синтезировать, колонии можно реплицировать на минимальные среды, дополненные специфическими соединениями (например, аминокислотами, источниками углерода, витаминами и т. д.). Таким образом, с помощью процедуры репликационного посева можно одновременно проскринировать сотни колоний. Одной из технических ошибок может стать использование слишком влажных агаризованных сред, что приведет к сливанию колоний и контаминации всех культур на чашке. Это делает результаты совершенно недостоверными. Другой технической ошибкой является слишком сильное давление при переносе клеток с бархата на вторичные чашки. В этом случае после инкубации вторичных чашек образовавшиеся колонии могут перекрывать друг друга, создавая фенотипы роста, которые будут ошибочно приняты за результат контаминации, а не ауксотрофии.

Не все виды микроорганизмов дикого типа являются прототрофами, поэтому процедура репликации на чашки может быть использована для одновременного скрининга различных штаммов дикого типа на наличие характерных требований к росту. Как показано на Рисунке 13, «отпечатки» клеток четырех различных бактериальных штаммов Pseudomonas были высеяны в двух повторностях на чашку с нанесенной сеткой, содержащую полную среду YTA (панель A). Затем штаммы были реплицированы на три вторичные чашки (панели B, C и D), содержащие минимальную среду (MSA), дополненную различными источниками углерода (ацетамидом, лактозой и глицином соответственно). Результаты показывают, что два из четырех штаммов Pseudomonas (P. aeruginosa и P. stutzeri) не способны расти на этих трех источниках углерода. В качестве контроля штаммы были реплицированы на четвертую чашку со средой YTA, чтобы подтвердить перенос клеток в ходе всей процедуры. Поскольку все четыре штамма растут на контрольной чашке с YTA, дефициты роста, наблюдаемые на предыдущих трех чашках серии, являются достоверными. Результаты репликации представлены в Таблице 1. Распространенной ошибкой является интерпретация отпечатка роста на вторичной чашке как положительного результата. Например, сравните фенотип P. aeruginosa с фенотипом P. stutzeri на MSA+ацетамид (панель B). Последний демонстрирует отпечаток роста, что является отрицательным результатом; такое может произойти, если питательные вещества с предыдущей чашки переносятся вместе с родительскими клетками. Нового роста клеток не происходит, так как недостающие питательные вещества недоступны для дочерних клеток. Легко спутать отпечаток с фактическим ростом. В случае сомнений эксперимент следует повторить, используя альтернативный метод, например, посев штрихом клеток с первичной чашки на вторичные среды.

Бактериальная культура на чашке с агаром; эксперимент по росту микробов; исследование морфологии колоний.
Рисунок 1. Пример изолированных колоний на чашке. Розовые сферы ближе к центру чашки представляют собой колонии Serratia marcescens, грамотрицательной палочковидной протеобактерии из семейства Enterobacteriaceae. Из-за предпочтения влажной среды этот микроорганизм часто встречается в углах ванн, в раковинах, в затирке плитки и на занавесках для душа. S. marcescens легко узнать по вырабатываемому красноватому пигменту — продигиозину. Колонии на данной чашке были получены методом посева штрихом; изолированные колонии появились в четвертом квадранте после инкубации при 30 °C в течение 24 часов. В остальных трех квадрантах наблюдается сливной рост, при котором клетки, нанесенные на поверхность агара, развились в перекрывающиеся колонии.

Инструменты и материалы для инокуляции в микробиологии, включая петлю, иглу, палочки; лабораторная установка.
Рисунок 2. Инструменты, используемые в методе посева штрихом. Сверху вниз показаны зубочистки (плоские, не круглые), проволочная петля, одноразовая пластиковая петля и деревянные палочки. Зубочистки обычно помещают в небольшой стеклянный стакан широким концом вниз, затем закрывают фольгой и автоклавируют для стерилизации перед использованием. Деревянные палочки помещают в пробирки диаметром 18 mm, после чего автоклавируют для стерилизации перед использованием.

Схема метода посева по квадратам; изоляция микроорганизмов; стерилизация петли; показаны результаты инкубации.
Рисунок 3. (A) Техника посева на чашку Петри методом четырех квадратов. С помощью предварительно стерилизованной петли, палочки или зубочистки образец распределяют по одной четверти поверхности агара быстрыми, плавными движениями вперед-назад от края к центру чашки. Это действие повторяют для каждого из четырех квадратов чашки. После инкубации рост клеток наблюдается вдоль траектории движения инструмента, использованного для нанесения клеток на чашку. Механическое разделение клеток в смешанной пробе с помощью данной техники должно привести к появлению одиночных колоний в четвертом квадрате (пример см. на Рисунке 1). Одиночные колонии называют колониеобразующими единицами (кое). (B) При использовании металлической петли для посева ее необходимо стерилизовать в пламени горелки Бунзена перед контактом с инокулятом или агаровой средой. Помните, что самой горячей частью пламени является вершина синего конуса. Держась за ручку инструмента, поместите проволоку в пламя примерно в 3-4 дюймах от петли. Выдержите ее достаточно долго, чтобы проволока раскалилась докрасна. Переместите проволоку так, чтобы пламя достигло петли. Перед контактом с инокулятом обязательно дождитесь охлаждения металлической петли.

Стерилизация инокуляционной петли, установка горелки Бунзена, микробная культура, диаграмма лабораторного процесса.
Рисунок 4. Метод посева в глубокий слой агара. (A) Небольшой объем образца (от 0.1 до 1.0 ml) асептически переносят в пустую стерильную чашку Петри с помощью серологической пипетки объемом 5.0 ml. (B) Затем в чашку Петри с образцом заливают расплавленный агар, доведенный до температуры примерно 48 °C. После закрытия крышки чашку осторожно встряхивают круговыми движениями для перемешивания образца с расплавленным агаром. Агару дают затвердеть в течение примерно 30 минут, после чего чашки переворачивают для инкубации.

Схема культивирования в чашке Петри; асептическая техника, иллюстрация лабораторного эксперимента, бактериальная культура.
Рисунок 5. Метод посева на поверхность агара с использованием поворотного столика и стеклянного шпателя. После размещения чашки с агаром на поворотном столике небольшой объем образца (0,1–0,2 ml) асептически вносят в центр чашки с помощью микропипетки. Шпатель стерилизуют, погружая его в стакан с этанолом, а затем пронося через пламя горелки Бунзена для воспламенения излишков этанола. Перед контактом с образцом шпатель необходимо охладить, прикоснувшись им к агару у края чашки. Шпатель осторожно перемещают вперед и назад через образец по всей площади чашки, в то время как поворотный столик медленно вращается. Это обеспечивает постепенное и равномерное распределение образца по поверхности агара. После закрытия крышки чашку следует оставить на столе в неподвижном состоянии минимум на 5 минут, чтобы образец полностью впитался в агар перед переворачиванием чашки для инкубации.

Процесс инокуляции чашки Петри с установкой горелки Бунзена; схема микробиологического эксперимента.
Рисунок 6. Метод посева штрихом с использованием стеклянных шариков (метод «Копакабана»). Стеклянные шарики, предварительно стерилизованные в автоклаве, высыпают на поверхность агарной пластины, лежащей на лабораторном столе. Небольшой объем образца (100–150 μl) асептически вносят в центр агара с помощью микропипетки. При закрытой крышке пластины горизонтальными встряхивающими движениями осторожно перемещают шарики вперед и назад по всей поверхности пластины 6–7 раз, распределяя образец. Эту процедуру повторяют после поворота пластины на 60°. Встряхивание повторяют в третий раз после еще одного поворота на 60°. После полного впитывания образца в агаровую среду шарики высыпают в стакан с 10% раствором отбеливателя. Затем пластины переворачивают для инкубации.

Сравнение роста бактерий на чашках с агаром; эксперимент, демонстрирующий образование колоний по сравнению с контрольным результатом.
Рисунок 7. Метод мягкого агарового слоя, используемый для изоляции и количественного определения фагов по образованию бляшек (также называемый методом определения бляшек). (A) Присутствие фагов можно обнаружить в виде зон просветления, или бляшек, на слитной суспензии бактериальных колоний, растущих в мягком агаре. Фаг T4 — это вирулентный фаг с двухцепочечной ДНК, который заражает своего хозяина, Escherichia coli, вызывая лизис клеток хозяина и высвобождение дочерних фагов. После нескольких циклов инфекции и лизиса соседние клетки E. coli в непосредственной области вокруг первоначальной зараженной клетки хозяина исчезают, оставляя бляшку, содержащую миллиарды частиц фага T4. Фаг T4 образует бляшки диаметром примерно 1 mm. В этом эксперименте 200 μl разведения 10-5 стока фага T4 с концентрацией 2 x 108 pfu/ml смешивали с примерно 300 μl индикаторных клеток E. coli, приготовленных в виде экспоненциально растущей аэрируемой культуры при 37 °C. И фаги, и бактерии добавляли в пробирку с мягким агаром EHA, перемешивали, а затем выливали на поверхность чашки с твердым агаром EHA. Обратите внимание, что в данном случае не было необходимости допускать адсорбцию фагов на бактериях перед посевом. После того как мягкий агар застывал в неподвижном состоянии в течение 20 минут, чашки переворачивали и инкубировали при 37 °C в течение 24 часов. (B) В отсутствие инфицирующих частиц фага рост бактерий приводит к образованию мутной суспензии клеток в мягком агаре, в которой отдельные колонии не видны. Вместо этого по всему слою мягкого агара формируется равномерный бактериальный газон, в данном случае из клеток E. coli.

Схема техники инокуляции; представлены правильные и неправильные паттерны в формате сетки.
Рисунок 8. Подготовка первичного планшета (мастер-планшета) с образцами бактерий. Для систематизации образцов на дне планшета можно начертить сетку и пронумеровать получившиеся квадраты. Каждому образцу может быть назначен свой квадрат в сетке. Показаны примеры правильного и неправильного паттернов инокуляции. В идеале небольшое количество клеток переносят в центр квадрата, используя стерильный инструмент для инокуляции, например зубочистку, чтобы «прикоснуться» к образцу (ячейка №4). Распространенные ошибки инокуляции, такие как представленные в ячейке №5 («пятно») и ячейке №6 («заполнение»), приводят к избыточному росту бактериальных образцов после инкубации, что в результате вызывает контаминацию соседних квадратов.

Процесс репликационного посева, схема переноса микробных колоний на вельвет, сравнение роста.
Рисунок 9. Метод репликационного посева, используемый для переноса клеток с первичных на вторичные чашки для фенотипического скрининга. Метка на первичной чашке совмещается с меткой на блоке, покрытом вельветом, после чего блок опускается так, чтобы поверхность агара соприкасалась с тканью. Клетки переносятся с чашки на вельвет путем легкого, но равномерного нажатия на первичную чашку кончиками пальцев. В результате этого действия на вельвете остается отпечаток образцов клеток в том же пространственном расположении, что и на первичной чашке. Та же процедура используется для переноса клеток с вельвета на вторичную чашку. С помощью одного отпечатка на вельвете можно инокулировать до 7-8 вторичных чашек. Последняя чашка, инокулированная с вельвета, должна служить положительным контролем. Она должна содержать среду, поддерживающую рост всех тестируемых штаммов, что подтверждает достаточный перенос клеток на протяжении всей серии чашек. После инкубации вторичные чашки можно осмотреть и оценить по наличию или отсутствию роста. Таким образом, в одном эксперименте можно одновременно проводить скрининг нескольких бактериальных штаммов на различных средах для роста.

Рост бактериальных колоний в чашке Петри, микробиологический эксперимент, анализ культуры.
Рисунок 10. Пример результата с использованием метода посева в пласт (pour-plate technique). Образец воды объемом 1.0 ml, взятый из общественного питьевого фонтанчика, был помещен в стерильную пустую чашку Петри. Затем в чашку с образцом заливали расплавленный, но охлажденный YTA-агар. Агар также содержал 100 μg/ml циклогексимида для предотвращения роста дрожжей и плесневых грибов, которые могли присутствовать в пробе воды. После осторожного перемешивания путем вращения чашку ставили на плоскую поверхность и дожидались полного затвердевания агара. Чашку инкубировали при 37 °C в течение 48 часов. Представлен результат данного эксперимента. Обратите внимание на различие во внешнем виде поверхностных колоний, которые имеют крупную круглую форму, и подповерхностных колоний, которые очень малы и имеют неправильную форму, поскольку затвердевшая среда препятствует распространению колоний в толще агара.

Рост бактериальных колоний на чашке с агаром; установка для микробиологического эксперимента; анализ клеточных культур.
Рисунок 11. Пример результата с использованием метода посева путем распределения по поверхности. Для посева смеси клеток E. coli в рамках скринингового эксперимента использовался «метод Копакабана». В данном случае питательная среда (LB) содержит X-Gal, поэтому клетки, экспрессирующие функциональный фермент β-галактозидаза, образуют синие колонии, тогда как клетки с мутацией в гене lacZ, неспособные экспрессировать функциональную β-галактозидазу, образуют белые колонии. При таком подходе, который часто называют «сине-белым скринингом», два типа колоний легко отличить друг от друга на одной и той же чашке.

Рост колоний на агаровых пластинах; контрольный и экспериментальный результаты; микробиологический анализ.
Рисунок 12. Пример результата метода определения количества бляшек (плак-анализа) с использованием техники мягкого агарового слоя. Показаны бляшки, образованные на штамме-хозяине Mycobacterium smegmatis mc2155 (ATCC 700084) двумя различными фагами: (A) микобактериофагом Destroyers и (B) микобактериофагом MSSS. Эти фаги были выделены студентами в ходе лабораторного курса MIMG 103L в UCLA весной 2010 года. M. smegmatis представляет собой непатогенную актиномицетообразную бактерию (Actinobacterium) и относится к семейству микобактерий, в которое входят несколько патогенов, вызывающих серьезные заболевания, такие как туберкулез (M. tuberculosis, M. africanum, M. bovis) и лепра (M. leprae). Примерно 50 μl разведения 10-2 Destroyers и 10-3 MSSS инкубировали с 500 μl M. smegmatis в течение 20 минут при 37 °C, затем смешивали с MBTA (мягким агаром) и разливали на пластины с MHA (твердым агаром). После того как мягкий агар застыл в состоянии покоя в течение 20 минут, пластины переворачивали и инкубировали при 37 °C в течение 48 часов. Обратите внимание на различную морфологию бляшек, созданных каждым фагом. Destroyers (A) образует мелкие (средний диаметр примерно 1 mm) прозрачные бляшки, характерные для литического фага, тогда как MSSS (B) формирует крупные бляшки типа «бычий глаз» с прозрачным центром, окруженным мутным ореолом (средний диаметр примерно 3.2 mm). Туманчатое кольцо может состоять из бактерий, устойчивых к инфекции фагами. Эта картина отличается от той, что создается лизогенными фагами, которые образуют мутные бляшки.

Эксперимент по росту бактерий; результаты в чашках Петри при сравнении видов Pseudomonas, культуры на агаре.
Рисунок 13. Пример результата с использованием метода репликационного посева. Четыре штамма Pseudomonas (P. aeruginosa, P. putida, P. fluorescens и P. stutzeri) тестировали в дубликатах на способность к росту на трех различных источниках углерода: ацетамиде, лактозе и глицине. (A) Первичная чашка содержит полную среду (YTA), инокулированную четырьмя указанными штаммами. После инкубации при 30 °C в течение 24 часов все четыре штамма растут на YTA. Первичная чашка использовалась для репликационного посева на минимальную среду (MSA), дополненную одним источником углерода: ацетамидом (B), лактозой (C) и глицином (D). Последней чашкой в серии была чашка с положительным контролем на среде YTA (E). Как показано, штаммы демонстрируют различные паттерны роста после инкубации на вторичных чашках. Обратите внимание, что иногда бывает трудно отличить рост от отпечатка клеток. Например, сравните отпечаток, оставленный P. stutzeri на трех чашках с MSA, с отсутствием роста тех же трех чашек у P. aeruginosa. Оба случая являются отрицательными результатами по сравнению с паттернами роста, продемонстрированными P. putida и P. fluorescens. Однако все штаммы растут на чашке с положительным контролем, что подтверждает перенос клеток на все вторичные чашки серии. Результаты этого эксперимента представлены в Таблице 1.

 YTA
(основная среда)		MSA +
ацетамид		MSA +
лактоза		MSA +
глицин		YTA
(контроль)
P. aeruginosa+---+
P. putida+++++
P. fluorescens+++++
P. stutzeri+---+

Таблица 1. Сводные результаты репликационного посева. Рост обозначен знаком плюс (+), отсутствие роста — знаком минус (-). YTA — полная среда (дрожжевой триптоновый агар), MSA — минимальная среда (минимальный солевой агар). В чашки с MSA был добавлен один источник углерода, как указано в таблице.

Обсуждение

Культивирование микроорганизмов включает в себя ряд методов гальванического покрытия, каждый из которых требует соблюдения асептической техники на протяжении всего процесса манипуляций с клетками и средами. В этом протоколе было описано пять различных процедур. Несмотря на то, что эти методы нанесения покрытий обычно используются для манипулирования бактериями и фагами, они также могут быть применены к культурам клеток млекопитающих и эукариотическим микроорганизмам, обычно используемым в молекулярной генетике, таким как дрожжи (например, Saccharomyces cerevisiae, Candida albicans, Schizosaccharomyces pombe), водоросли и простейшие ( например, Volvox, Chlamydomonas, Amoeba, Paramecium) и нематоды (например, Caenorhabditis elegans). Существуют также многочисленные (и даже более сложные) вариации каждого метода гальванического покрытия в зависимости от цели эксперимента или изучаемого организма. Таким образом, важно не только выбрать наиболее подходящий метод для данного эксперимента или целевого микроорганизма, но и адаптировать методологию таким образом, чтобы результаты эксперимента адекватно отвечали исследовательскому вопросу или проблеме.

Некоторые из наиболее современных применений методов нанесения покрытий, обсуждаемых в этом протоколе, связаны с технологическими достижениями, которые дают высокопроизводительные результаты для экспериментов по скринингу и открытию лекарств. Например, центры секвенирования генома используют «метод Копакабана» для расширения библиотек клонов, которые представляют собой клетки E. coli , трансформируемые плазмидами, содержащими фрагменты ДНК, полученные из генома микроорганизма. Поскольку десятки больших тарелок (называемых лотками для биопроб) подготавливаются одновременно, для встряхивания стеклянных бусин используется автоматизированный встряхиватель для всей партии лотков. Кроме того, при отборе колоний из этих планшетов после инкубации используется роботизированный подборщик колоний для сбора клеток из соответствующих колоний в качестве инокулюма для LB-бульона в 384-луночных микропланшетах. Для этого высокопроизводительного скринингового анализа применяются процедурные принципы метода распыления пластин, но технология позволяет автоматизировать и масштабировать различные этапы, чтобы обеспечить одновременный анализ большого количества образцов и в течение короткого периода времени.

Биотехнологические и фармацевтические компании вкладывают значительные ресурсы в разработку высокопроизводительных технологий для самых основных методов в микробиологии и молекулярной генетике. Например, существуют многоканальные микропипетторы для одновременной передачи объема до 8 или 12 образцов. Существуют даже роботизированные рабочие станции, которые управляют 96-канальной головкой дозатора! В этих усилиях участвуют междисциплинарные команды ученых, объединяющие биологов, обладающих методологическими знаниями, с инженерами и программистами, которые могут разработать инструменты, необходимые для выполнения механических операций, связанных с экспериментами. Независимо от области применения исследований, цели, разделяемые компаниями, разрабатывающими эти технологии, одна и та же – автоматизировать лабораторные процессы, инструменты, системы и приборы, сделав их менее трудоемкими и более эффективными.

Раскрытие информации

Мне нечего раскрывать.

Благодарности

Особая благодарность Кори Сандерсу из Iroc Designs за подготовку иллюстраций и Крису Редди и Бхайраву Шаху из UCLA за создание образцов культур и помощь с фигурами. Финансирование этого проекта было предоставлено HHMI (грант HHMI No 52006944).

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии

1. Дрожжевой триптон агар (YTA) < тело> <тр> <тр> <ТД>10,0 г <тр> <тр> <тд>до 1000,0 мл <тр>

Автоклав на 121° C в течение 20 минут стерилизовать. Хранить при 4&�C.

Если вы готовите пробирки для процедуры заливки, дайте агару остыть до ~55° Затем добавьте 2,0 мл 50 мг/мл циклогексимида. Асептически дозируйте 18,0 мл расплавленного агара на пробирку 18 мм, затем храните при температуре 4°C. Агар затвердеет, и перед использованием его нужно будет расплавить в пароварке или микроволновой печи.

2. Агар с минимальным содержанием солей (MSA) + 0,1% (w/v) источника углерода

Экстракт дрожжей 2.0 гTryptoneAgar15,0 гДистиллированная водаpH 7,0

Автоклав на 121° C в течение 20 минут стерилизовать. Хранить при 4&�C.

* Источники углерода, используемые для экспериментов, представленных на рисунке 13, включают ацетамид, лактозу и глицин.

** Раствор следовых солей готовится в 0,1 Н HCl следующим образом. Его добавляют в основу перед стерилизацией (автоклав при 121°; C в течение 20 минут).

NH4Cl1.0 гNH2HPO4• 2H2OKH2PO4MgSO4• 7H2O0,2 гИсточник углерода*1.0 граствор следовых солей**Agar15,0 гДистиллированная водаpH 7,0
< тело> <тр> <тр> <ВД>2,14 г <тр> <ВД>1,09 г <тр> <тр> <тр> <тад>10,0 мл <тр> <тр> <тд>до 1000,0 мл <тр> < тело> <тр> <тр> <тад>180,0 мг <тр> <тад>130,0 мг <тр> <тад>40,0 мг <тр> <тад>20,0 мг <тр> < тад>1,0 мг <тр> <тад>1000,0 мг <тр> <тд>до 1000,0 мл

3. Мягкий агар ЭГА (0,65 % мас.)

FeSO4• 7H2O300.0 мгMnCl2• 4H2OCo(NO3)2• 6H2OZnSO4.7H2OH2MoO4CuSO4• 5H2OCaCl2HCl (0,1 N)

Автоклав на 121° C в течение 20 минут стерилизовать. Хранить при 4&�C.

4. Твердый агар EHA (1,2% по объему)

Agar6,5 гTryptoneNaClNa Citrate• 2H2O2.0 гGlucose3.0 гДистиллированная вода
< тело> <тр> <тр> <ТД>13,0 г <тр> <ТД>8,0 г <тр> <тр> <тр> <тд>до 1000,0 мл < тело> <тр> <ТД>12,0 г <тр> <ТД>13,0 г <тр> <тр> <тр> <тад> 3,0 г <тр> <тд>до 1000,0 мл

Автоклав на 121° C в течение 20 минут стерилизовать. Хранить при 4&�C.

5. 1X Верхний агар Миддлбрук (мягкий агар MBTA, 0,5% мас./об.)

AgarTryptoneNaCl 8,0 гNa Citrate• 2H2O 2,0 гGlucoseДистиллированная вода

Растопите 50 мл 2XTA и дайте ему остыть до ~55°C. Используя асептическую технику, добавьте CaCl2 и бульон 7H9 в растопленный агар. Асептически дозировать 4,5 мл смеси на тубу 13 мм и хранить при температуре 55°С; C инкубатор ≤ 7 дней. Охлаждение MBTA до комнатной температуры или 4°С; C приведет к тому, что CaCl2 выпадет в осадок из раствора.

* 100 mM CaCl2. Запас необходимо хранить при комнатной температуре, чтобы предотвратить выпадение CaCl2 из раствора.

** Жидкая среда 7H9: Чистый

100 mM CaCl2 stock*7H9: Neat **2XTA ***
< тело> <тр> <тд> 1 мл <тр> Жидкая среда <тап>50 мл <тр> <тап>50 мл < тело> <тр> <тр> <тд>5 мл <тр> <тд>до 900,0 мл

Смешайте основу с водой, затем добавьте глицерин, помешивая. Автоклав на 121° C в течение 20 минут стерилизовать. Хранить при 4&�C.

*** 2X Middlebrook Top Agar (2XTA, 1,0% w/v)

7H9 бульонная основа4,7 г40% запасы глицеринаДистиллированная вода

Автоклав на 121° C в течение 20 минут стерилизовать. Разложите аликвоты по 50 мл во флаконы по 100 мл и храните при температуре 4°C.

6. Пластины агара Миддлбрук 7H10 (твердый агар MHA, 1,9% по объему)

7H9 бульонная основа4,7 гAgar1.0 гДистиллированная водадо 1000,0 мл
< тело> <тр> <тр> <тр> < тело> <тр> Агаровая база <тр> <тд>12,5 мл <тр> <ТД>887,5 мл

Смешайте основу агара с водой, затем добавьте глицерин, помешивая. Нагрейте раствор до кипения, затем помешивайте в течение одной минуты до полного растворения основного порошка. Автоклав на 121° C в течение 20 минут стерилизовать. Дайте агару остыть до ~55°°; Затем С асептически добавляют следующие реагенты:

7H1019,0 г40% запасы глицеринаДистиллированная вода

* AD supplement

AD (предварительно подогретая до 37°С; C)*50 мг/мл Карбенициллин**
< тело> <тр> Добавка <тд>100 мл <тр> <тад>1,0 мл <тр> <тд>10 мг/мл Циклогексимид** <тад>1,0 мл < тело> <тр>
NaCl > 17 г > <тр> Альбумин (фракция V)> 100 г <тр> Dextrose (D-Glucose)> 40 г <тр> Дистиллированная вода> до 2000,0 мл

Фильтр-стерилизуйте этот раствор; Не автоклавировать. Хранить при 4&�C.

** Фильтруйте-стерилизуйте и храните эти растворы при 4° C для ≤ 60 дней.

7. LB агар (1,5% w/v) + X-Gal (60 μ г/мл) < тело> <тр> <ТД>10,0 г <тр> <тр> <ТД>10,0 г <тр> <тр> <тд>до 1000,0 мл <тр>

TryptoneЭкстракт дрожжей5,0 гNaClAgar15,0 гДистиллированная водаpH 7,5 при 25°С; К

Автоклав на 121° C в течение 20 минут стерилизовать. Дайте агару остыть до ~55°°; Затем асептически добавьте 3,0 мл 20 мг/мл раствора X-Gal. Свежеприготовленный бульон X-gal растворить 400 мг X-Gal в 20 мл диметилформамида (DMF).

Таблица конкретных реагентов: < тело> <тр> <тр> <тр> <тр> <тр> <тр> <тр> <ТД>ВР 303-500 <тр> <тр> <тр> <тр> <тр> <тр> <ТД>М-3634 <тр> <тр> <тр> <тр> <тр> <тр> <тр> <тр> <тр> <тр> <тр> <тр> <тр> Агаровая база <тр> <тр> <тд>альбумин (фракция V) <тр> <тр> <тр> <тр> <тр>

Таблица конкретного оборудования:

Наименование реагентаCompanyКаталожный номерЭкстракт дрожжейBecton Dickenson212750TryptoneBecton Dickenson211705AgarBecton Dickenson214030NH4ClAcros Organics123340010NH2HPO4• 2H2OSigma-Aldrich30435KH2PO4Fisher ScientificMgSO4• 7H2OSigma-Aldrich230391 AcetamideSigma-Aldrich A-0500ЛактозаFisher Scientific L6-500 GlycineSigma-AldrichG-7126FeSO4• 7H2OSigma-AldrichF8048MnCl2• 4H2OSigma-AldrichCo(NO3)2• 6H2OSigma-Aldrich230375ZnSO4.7H2OSigma-AldrichZ4750H2MoO4Acros Organics213621000CuSO4• 5H2OSigma-Aldrich209198 CaCl2Sigma-AldrichC1016 HClFisher ScientificA144-212CycloheximideSigma038K1561CarbenicillinCellgro46-100-RGNaClFisherS271-1Na Citrate• 2H2OFisherS279-500глюкоза (декстроза)BD2155307H9 бульонная основаBD2713107H10BD262710GlycerinSheltonIB15760FisherS71907X-Gal (5-бром-4-хлор-3-индолил-β-D-галактопиранозид) TeknovaX1205Диметилформамид (DMF)SigmaD4551EthanolFisherCDA19Хлорный отбеливательChlorox02490/06644884CiDecon (дезинфицирующее средство)Decon Laboratories, Inc.8504
Наименование оборудованияCompanyКаталожный номерExperimentМеталлические петлиAmerican Educational ProductsS17352Streak platingОдноразовые пластиковые петлиFisher22-363-602Streak platingДеревянные палочкиFisher23-400-104Streak platingПлоские зубочисткиAmerican Educational ProductsS67859Streak platingПоворотные столыFisher08-758QSpread PlatingСтеклянные стержниBellco GlassNC9004380Spread Plating4 ммFisher11-312BSpread PlatingVelveteenBel-Art Products09-718-2Реплика гальванического покрытияЦилиндрический блокBel-Art Products09-718-1Реплика гальванического покрытия
< тело> <тр> <тр> <тр> <тр> <тр> <тр> <тр> <тр> Стеклянные шарики <тр> Вельветовая ткань <тр>

Ссылки

  1. Barker, K. At the Bench: A Laboratory Navigator. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. (1998).
  2. US Department of Health and Human Services (DHHS). Biosafety in Microbiological And Biomedical Laboratories (BMBL). , 5th, U.S. Government Printing Office. Washington DC. Available from: http://www.cdc.gov/biosafety/publications/bmbl5/index.htm (2009).
  3. Dulbecco, R., Vogt, M. Some problems of animal virology as studied by the plaque technique. Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 18, 273-279 (1953).
  4. Fields, B. N., Knipe, D. M., Chanock, R. M., Hirsch, M. S., Melnick, J. L., Monath, T. P., Roizman, B. Fields Virology. 1, 2nd, Raven Press. New York, NY. (1991).
  5. Gilbert, R. A., Ouwerkerk, D., Zhang, L. H., Klieve, A. V. Cooperative Research Center for Beef Genetic Technologies. In vitro detection and primary cultivation of bacteria producing materials inhibitory to ruminal methanogens. Journal of Microbiological Methods. 80, 217-218 (2010).
  6. Jett, B. D., Hatter, K. L., Huycke, M. M., Gilmore, M. S. Simplified agar plate method for quantifying viable bacteria. BioTechniques. 23, 648-650 (1997).
  7. Karam, J. D. Molecular Biology of Bacteriophage T4. , ASM Press. Washington, DC. (1994).
  8. Knipe, D. M., Howley, P. M., Griffin, D. E., Lamb, R. A., Martin, M. A., Roizman, B., Straus, S. E. Fundamental Virology. , 4th, Lippincott, Williams, and Wilkins. Philadelphia, PA. (2001).
  9. Lederberg, J., Lederberg, E. M. Replica plating and indirect selection of bacterial mutants. J. Bacteriol. 63, 399-406 (1952).
  10. Miller, J. H. A Short Course in Bacterial Genetics: A Laboratory Manual and Handbook for Escherichia coli and related bacteria. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Plainview, NY. (1992).
  11. Mills, K. V., Gareau, J. R., Garcia, A. M. Low-cost modification to the Copacabana method for spreading transformation mixtures. BioTechniques. 39, 188(2005).
  12. Jordan, T., et al. RESEARCH: National Genomics Research Initiative Phage Resource Laboratory Manual. , Howard Hughes Medical Institute. (2008).
  13. Sambrook, J., Russell, D. W. Molecular Cloning - A Laboratory Manual. , 3rd, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. (2001).
  14. Sanders, E. R., Miller, J. H. I. Microbiologist: A Discovery-based Course in Microbial Ecology and Molecular Evolution. , ASM Press. Washington, DC. (2010).
  15. Slonczewski, J. L., Foster, J. W. Microbiology - An Evolving Science. , 2nd, W.W. Norton & Co., Inc. New York, NY. (2011).
  16. Teather, R. M., Wood, P. J. Use of Congo Red-Polysaccharide Interactions in Enumeration and Characterization of Cellulolytic Bacteria from the Bovine Rumen. Applied and Environmental Microbiology. 43, 777-780 (1982).
  17. Wise, K. Preparing Spread Plates Protocols. , Available from: http://www.microbelibrary.org/index.php/component/resource/laboratory-test/3085-preparing-spread-plates-protocols (2006).
  18. Worthington, M., Luo, R. Q., Pelo, J. Copacabana method for spreading E. coli and yeast colonies. BioTechniques. 30, 738-742 (2001).
  19. American Type Culture Collection (ATCC). , Available from: http://www.atcc.org/ (2012).
  20. EPA Microbiology Home Page. , Available from: http://www.epa.gov/nerlcwww/index.html (2012).
  21. The GENE Project: Laboratory Methods and Materials. , Available from: http://www.phys.ksu.edu/gene/g1.html (2012).
  22. Joint Genome Institute (JGI) Genome Sequencing Protocols: Library Plating Protocol. , Available from: http://www.jgi.doe.gov/sequencing/protocols/prots_production.html (2012).
  23. Microbial Genetics (maintained by Stanley Maloy at UCSD). , Available from: http://www.sci.sdsu.edu/~smaloy/MicrobialGenetics (2012).
  24. Organization of American States (OAS) Department of Sustainable Development (DSD). , Available from: http://www.oas.org/DSD/publications/Unit/oea59e/ch26.htm (2012).
  25. Public Health Agency of Canada: Material Safety Data Sheets (MSDS) for Infectious Substances. , Available from: http://www.phac-aspc.gc.ca/msds-ftss (2012).
  26. United States Environmental Protection Agency (EPA) Office of Water. , Available from: http://water.epa.gov (2012).
  27. American Society for Microbiology (ASM)'s Curriculum Recommendations Microbiology Majors Program. , Available from: http://www.asm.org/asm/index.php/unknown/asm-s-curriculum-recommendations-microbiology-majors-program.html (2012).
  28. Introductory Course in Microbiology. , Available from: http://www.asm.org/asm/index.php/unknown/asm-s-curriculum-recommendations-introductory-course-in-microbiology.html (2012).

Перепечатки и разрешения

Теги

Асептики лаборатории: Покрытие методы
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.