Введение бактериальных эффекторных белков в клетки млекопитающих методом электропорации

Аннотация

Источник: Sontag, R. L. et al., Электропорация функциональных бактериальных эффекторов в клетки млекопитающих. J. Vis. Exp. (2015)

В этом видео мы демонстрируем введение бактериальных эффекторных белков в клетки млекопитающих с помощью электропорации. Внутриклеточная локализация бактериальных эффекторных белков определяется с помощью конфокальной микроскопии после окрашивания специфическими флуорофор-конъюгированными антителами.

Протокол

1. Электропорация

1. Поместите 400 μл клеточной суспензии в предварительно охлажденную кювету и добавьте в кювету 20 μг выбранного белка (50 μг/мл).
2. Осторожно перекрутите кювету ~10 раз, чтобы перемешать, не повредив клетки. заметка: Кювета также может быть перевернута несколько раз для тщательного перемешивания, но не пипетируйте вверх и вниз и не делайте вихрей, чтобы не повредить клетки.
3. Вытрите кювету снаружи бумажным полотенцем или другим стеклоочистителем, чтобы избежать образования электрической дуги в электропоре
.
4. Электропорировать образец при напряжении 0,3 кВ в течение 1,5-1,7 мс. Примечание: Это было характерно для данного исследования.
5. Сразу после электропорации осторожно переверните кювету ~10 раз, чтобы тщательно перемешать.

2. Покрытие ячеек

1. Храните кювету с электропорированными ячейками на льду до готовности к размещению в восстановительных планшетах.
2. Для большинства последующих анализов промойте клетки 1 раз предварительно подогретым NGM для удаления постороннего эффекторного белка.
   1. Извлеките клетки для анализа и суспензируйте в 3-5 мл NGM.
   2. Пеллетные ячейки методом центрифугирования при давлении 900 x g в течение 4 мин.
   3. Повторно суспендируйте в достаточном объеме NGM для желаемого размера тарелки (например, 2 мл для чашки диаметром 35 мм).
3. Удалите соответствующее количество ячеек для последующего анализа.
   1. Пример 1: Вставьте чашку со стеклянным дном для микроскопического анализа.
   2. Пример 2: Пластина в пластик клеточной культуры для анализа белка, такого как аффинная очистка.
4. Дайте клеткам восстановиться в уравновешенных планшетах во влажной атмосфере 95% воздуха/5%_CO2 при 37°C в течение не менее 4 часов.

3. Микроскопический анализ

1. Фиксация/иммунофлюоресцентное окрашивание
   1. Промойте камеры 1x стерильным PBS после 4-часового восстановительного периода.
   2. Зафиксируйте ячейки в 100% метаноле на 2 минуты при комнатной температуре. Используйте достаточное количество метанола, чтобы полностью покрыть клетки (например, 2 мл для чашки диаметром 35 мм).
   3. Промыть 3 раза стерильным PBS.
   4. Пермеабилизируйте клетки 0,4% Triton X-100 в PBS в течение 15 мин. Например, используйте 1 мл для тарелки диаметром 35 мм.
      1. Отрегулируйте длину пермеабилизации и силу Triton X-100 в соответствии с эпитопом и расположением целевого белка. заметка: Наилучшие результаты должны быть определены эмпирически для каждой мишени, однако вышеуказанные условия должны быть адекватными для большинства цитозольных мишеней.
   5. Заблокируйте 5% бычьим сывороточным альбумином (BSA) в PBS в течение 1 часа в режиме RT. Например, используйте 1 мл для тарелки диаметром 35 мм.
   6. Постирайте 3 раза с PBS.
   7. Инкубируйте первичное антитело в растворе, связывающем антитела (0,1% Triton X-100 и 1% BSA в PBS) в течение ночи при 4 °C с легким покачиванием. Например, используйте 0,5 мл для тарелки диаметром 35 мм.
      1. Следуйте рекомендациям производителя по разведению антител. заметка: Например, антитело стрептавидин-связывающего пептида (SBP-метка) использовали при разведении 1:1000, в то время как антитело PKN1 использовали при разведении 1:200.
   8. Постирайте 4 раза с PBS.
   9. Инкубировать с соответствующими флуоресцентно конъюгированными вторичными антителами в растворе, связывающем антитело, в течение 1 часа при комнатной температуре, в защищенном от света месте.
      1. Например, используйте Alexa 488 или Alexa 647 в течение 1 часа при комнатной температуре.
         1. Следуйте рекомендациям производителя по разведению антител. (например, примерно 1:1,000 для этого исследования).
      2. При необходимости добавьте другие красители, например, 5 мкМ агглютинин зародышей пшеницы (WGA), конъюгированный с Alexa 647 или DAPI в соответствии с рекомендацией производителя, в течение 1 часа при комнатной температуре.
   10. Постирайте 5x с PBS и храните при температуре 4 °C в защищенном от света месте до готовности к изображению.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
0,25% раствор трипсин-ЭДТА	Селлгро	25-050-Кл
0,4 см Одноразовые кюветы для электропорации	Био-Рад	165-2088
100% метанол	любой	Н/Д	Легковоспламеняющийся, токсичный
Бычий сывороточный альбумин (BSA)	Сигма-Олдрич	А4919
Аппарат для подсчета клеток - гемоцитометр или счетчик сошников	Бекман Коултер	Модель Z1
Инкубатор для клеточных культур	любой	Н/Д	Увлажненный 95% воздуха/5% CO2 в атмосфере при 37 °C
Пластик клеточных культур	любой	Н/Д	Колбы/планшеты для клеточных культур, пипетки, пробирки, резиновые полицейские
Модификация Дульбекко Eagle's Medium (DMEM)	Селлгро	10-013	Прогреть до 37 °C
Электропоратор	Био-Рад	Пульсер E. coli
Фетальная бычья сыворотка (FBS)	Селлгро	35-016-СВ
Флуоресцентный конфокальный микроскоп	Зисс	Модель LSM 710
Стеклянные донные тарелки для микроскопии	Уилко Уэллс	HBSt-3522
Клеточная линия HeLa	АТКС	ATCC CCL-2
Minimal Essential Medium (MEM)	Селлгро	10-010 Телефонный номер 10-010	Прогреть до 37 °C
Другие флуоресцентные красители (WGA, DAPI) в сочетании с реагентом против выцветания	любой	Н/Д
Пенициллин/стрептомицин	Селлгро	30-002-Кл
RAW 264.7 Клеточная линия	АТКС	ТИБ-71
Первичное антитело против исследуемой мишени	любой	Н/Д
Вторичное антитело, конъюгированное с флуорофором	любой	Н/Д
Фосфатно-солевой буфер	любой	Н/Д	Охладить до 4 °C
Стерильный фосфатно-солевой буфер	любой	Н/Д	Прогреть до 37 °C
Настольная центрифуга, способная принимать конические пробирки (предпочтительно качающееся ведро)	любой	Н/Д
Тритон Х-100	Сигма-Олдрич	Т8585	Раздражающий, токсичный