Все процедуры, связанные с животными, были проверены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом JoVE.
1. Выращивание малассезии в лабораторных условиях
ПРИМЕЧАНИЕ: Храните все реагенты и среды, используемые для этого протокола, при комнатной температуре (RT, 20 – 25 °C), если не указано иное, так как более низкая температура может препятствовать росту грибков.
- Приготовьте жидкую модифицированную среду Dixon (mDixon) для роста Malassezia. Чтобы приготовить 500 мл жидкой среды mDixon, растворите 18 г солодового экстракта, 10 г высушенной бычьей желчи, 5 мл Tween-40, 3 г пептона, 1 мл глицерина и 1 мл олеиновой кислоты в 500 мл дистиллированной H2O (dH2O). Отрегулируйте среду до pH 6 с помощью HCl и автоклава. Храните носитель в RT.
- Приготовьте агаровые планшеты mDixon, добавив 7,5 г агара к 500 мл среды mDixon перед автоклавированием. Медленно охлаждайте агар mDixon после автоклавирования с помощью рулевого руля и магнитной нагревательной пластины, чтобы избежать частичного затвердевания среды при охлаждении.
- Как только агар остынет до 50 – 60 °C, раздайте жидкость в чашки Петри в ламинарном колпаке и дайте им высохнуть при RT в течение ночи.
заметка: Агаровые пластины можно хранить при температуре 4 °C в течение нескольких недель, когда они упакованы и держат вверх дном, чтобы избежать испарения.
- Получите изоляты Malassezia и оживите лиофилизированные запасы Malassezia в соответствии с инструкциями, полученными поставщиком.
- Инокулируйте 10 мл жидкой среды mDixon в стерильную колбу Эрленмейера объемом 100 мл с восстановленной суспензией Malassezia в соответствии с инструкциями, полученными поставщиком. Инкубируйте культуру в встряхивающем инкубаторе при температуре 30 °C и 180 об/мин.
- Регулярно осматривайте рост культуры Malassezia, проверяя на наличие кремового цвета и помутнения. Кинетика роста зависит от вида и штамма Malassezia и может быть особенно медленной, когда Malassezia только что возрождена из лиофилизированного поголовья. (Рисунок 1А).
- Приготовьте запасы глицерина, смешав 3 части плотно выращенной культуры Malassezia в среде mDixon с 1 частью стерильного 99% глицерина. Разложите смесь Malassezia/глицерина в стерильные пробирки с завинчивающейся крышкой и храните при температуре -80 °C.
- Для размножения in vitro наложите Malassezia из жидкой культуры в mDixon или из замороженного глицеринового материала на агаровый планшет mDixon (доведенный до RT с 4 °C) с использованием петли инокуляции.
заметка: Перед использованием перенесите пластины с агаром mDixon в режим RT от 4 °C, так как холодный агар mDixon подавляет рост грибков.
- Инкубируйте агаровую пластину (пластины) с Malassezia вверх дном в инкубаторе aN (без встряхивания) при температуре 30 °C. Регулярно проверяйте рост колоний Malassezia.
ПРИМЕЧАНИЕ: Колонии Malassezia на пластинах агара mDixon появляются в течение 3-5 дней и имеют кремовый тусклый цвет и гладкие с выпуклым возвышением (Рисунок 1B).
- Хранить колонии Malassezia на агаровых планшетах mDixon в RT в течение ~ 2 недель. После этого приготовьте новую агаровую пластину mDixon, отделив Malassezia от замороженного глицеринового бульона, как описано в 1.7.
2. Приготовление инокулюма для экспериментального заражения мышей Malassezia
- Инокулируйте 10 мл жидкой среды mDixon в стерильную колбу Эрленмейера объемом 100 мл 3-5 отдельных колоний Malassezia из агаровой пластины mDixon (см. шаг 1, рисунок 1B).
- Инкубируйте культуру Malassezia в течение ~ 48–96 ч при 30 °C и 180 об/мин до тех пор, пока культура не приобретет кремовый цвет и помутнение (рис. 1A).
заметка: Время, необходимое для роста Malassezia, зависит от вида и штамма Malassezia, а также от количества гриба, используемого для прививки.
- Переложите 2 мл культуры Malassezia в стерильную микроцентрифужную пробирку объемом 2 мл и центрифугируйте в течение 1 минуты при 10 000 x g.
- Выбросьте надосадочную жидкость и промойте гранулу, суспензив ее в 1 мл фосфатно-буферного раствора соли (PBS). Снова центрифугируйте в течение 1 минуты при 10 000 x g.
- После промывки суспензию гранулы в 1 мл PBS путем энергичного пипетирования и измерить оптическую плотность раствора при длине волны 600 нм (ODA600) с помощью спектрометра. Разбавьте суспензию Malassezia 20 – 50 x с PBS для измерения наружного диаметра, чтобы убедиться, что показания находятся в диапазоне от 0,1 до 1,
заметка: Плотность 3-дневной культуры Malassezia обычно колеблется от 15 до 30 ODA600, в зависимости от вида и штамма Malassezia, а также от количества дрожжевых клеток, используемых для инокуляции культуры (шаг 2.1). Malassezia имеет тенденцию образовывать агрегаты, поэтому для обеспечения однородности суспензии необходимо энергичное пипетирование.
- Аликвота – объем суспензии Malassezia в PBS, соответствующий плотности 4 ODA600 в стерильной пробирке объемом 2 мл. Подготовьте по 1 пробирке на каждое животное, которое будет инфицировано.
- Центрифугируйте пробирки, содержащие Malassezia, в течение 1 мин при давлении 10 000 x g.
- Выбросьте надосадочную жидкость и суспендируйте гранулы Malassezia в 200 мкл нативного оливкового масла (что соответствует 2 OD дрожжевых клетокA600 на 100 мкл оливкового масла).
заметка: Было обнаружено, что оливковое масло является хорошим средством для эпикутанной инфекции Malassezia, поскольку Malassezia является липофильными и липид-зависимыми дрожжами. Оливковое масло лучше усваивается кожей, чем PBS. Однако имейте в виду, что суспензию Malassezia в оливковом масле непросто. Улучшите суспензию Malassezia/оливкового масла с помощью вортексинга. Храните суспензию в RT до тех пор, пока она не будет использована для лечения инфекции.
- Подготовьте пробирки с одним только оливковым маслом для имитации заражения контрольных животных.
3. Заражение мышей Malassezia
- Закажите самок мышей C57BL/6 в возрасте от 6 до 8 недель и дайте им акклиматизироваться в экспериментальном помещении для животных в течение как минимум одной недели. Рассчитывайте на 3 - 5 мышей в группе, включая неинфицированную контрольную группу.
- Приготовьте стерильный обезболивающий коктейль, содержащий 1,3 мг/мл ксилазина и 6,5 мг/мл кетамина в PBS. 5 мл обезболивающего коктейля достаточно для обезболивания 20 животных. Отрегулируйте громкость коктейля в зависимости от количества животных, которых нужно обезболить.
- Обезболивайте животных путем внутрибрюшинного введения 10 мкл/г массы тела анестетического коктейля (что соответствует 65 мг кетамина и 13 мг ксилазина на кг массы тела) и поместите обезболенных животных на грелку при температуре 37 °C. <бр/>
заметка: При указанной дозе животные обычно остаются под наркозом в течение ~ 30 - 60 мин.
- Проверьте рефлексы, зажимая заднюю лапу щипцами, чтобы убедиться в полной анестезии животных.
- Нанесите крем для глаз на глаза, чтобы предотвратить обезвоживание во время анестезии.
- По желанию измерьте толщину уха обоих ушей с помощью штангенциркуля (диапазон 0 - 5 мм). Измерьте две разные области каждого уха и рассчитайте среднюю толщину уха. < чел/>
заметка: Измерение толщины уха не является обязательным и зависит от исследовательского вопроса. Однако, если толщина уха используется в качестве индикатора воспаления кожи, необходимо измерить исходную толщину уха до инфекции. (см. Шаг 4).
- По желанию можно нарушить эпидермальный барьер кожи тыльной стороны уха с помощью мягкого зачистки лентой: вручную наложите небольшой кусочек ленты на кожу и снимите его снова. Повторяйте в течение 5 последовательных раундов, используя свежий кусок скотча для каждого раунда.
ПРИМЕЧАНИЕ: Malassezia вызывает более выраженное воспаление кожи с нарушением барьерного барьера по сравнению с невозмутимой кожей (Рисунок 2A).
- Местно нанесите 100 мкл (2 ODA600) суспензии Malassezia/оливкового масла на тыльную сторону каждого уха с помощью стерильной пипетки. Включите контрольную группу животных, которых обрабатывают только оливковым маслом (контрольная группа, обработанная транспортным средством).
заметка: Энергично внесите суспензию Malassezia/оливкового масла, чтобы получить однородную суспензию Malassezia, непосредственно перед применением.
- Оставьте обезболенных животных на грелке, чтобы избежать переохлаждения до тех пор, пока у них не появятся признаки выздоровления (движение усов, учащенное дыхание и т.д.).
- Введите 200 мкл стерильного и предварительно подогретого 2% раствора глюкозы подкожно в затылочную складку для поддержки их метаболизма и регидратации.
заметка: Для приготовления стерильного 2% раствора глюкозы растворите 1 мг глюкозы в 50 мл PBS и отфильтруйте его с помощью фильтра 0,2 мкм. Раствор можно хранить при температуре 4 °C.
- Пересадите животных обратно в клетку.
4. Анализ воспаления кожи, вызванного Malassezia
ПРИМЕЧАНИЕ: Эта процедура описывает анализ вызванного Malassezia отека уха во время инфекции, который служит параметром воспаления кожи. Предварительным условием для анализа вызванного грибком отека уха является измерение исходной толщины уха до снятия ленты и/или инфицирования (шаг 3.5).
- Подготовьте изофлурановую камеру для кратковременной анестезии инфицированных Malassezia и контрольных животных.
- Перекладывайте по одному животному в камеру и ждите, пока животное полностью обезболится.
заметка: Признаки правильной анестезии включают полное расслабление тела, а также медленное и тяжелое (боковое) дыхание. Внимательно следите за анестезией, так как длительное воздействие изофлурана может привести к летальному исходу.
- Извлеките животное из камеры и положите его на салфетку.
- Измерьте толщину уха (ушей) с помощью штангенциркуля (диапазон 0 - 5 мм). Измерьте две разные области каждого уха и рассчитайте среднюю толщину каждого уха (см. шаг 3.5).
- Перенесите животное обратно в клетку.
заметка: Изофлурановая анестезия очень кратковременна, и животные восстанавливаются в течение ~ 30 с после удаления изофлурановой камеры.
- Рассчитайте увеличение толщины уха путем вычитания средней исходной толщины уха, измеренной до снятия пластыря и/или инфекции, из средней толщины уха, измеренной в каждый момент времени после инфекции.
- Нанесите рассчитанные значения на график как увеличение толщины колоса или, в качестве альтернативы, как общую толщину колоса с течением времени для каждого животного или группы животных (рисунок 2B).
5. Анализ грибковой нагрузки на инфицированную кожу
- Приготовьте стерильную микроцентрифужную пробирку объемом 2 мл для каждого собираемого уха, содержащую 0,5 мл стерильного 0,05% нонидета P40 (NP40) в dH2O и автоклавный стальной шарик (диаметром 5 мм).
- Взвесьте пробирки с помощью прецизионных весов и запишите точный вес.
- Усыпьте мышей путем удушенияСО2
.
- Удалите ухо (уши) у основания и перенесите в трубку, содержащую 0,5 мл стерильного 0,05% NP40 в dH2O, как описано в шагах 5.1 - 5.2.
- Взвесьте трубку, содержащую ткань уха, и рассчитайте фактический вес каждого образца, вычитая вес трубки без органа из веса трубки с органом.
- Гомогенизируйте ткани уха в течение 6 минут при частоте 25 Гц с помощью тканевого гомогенизатора. Следите за тем, чтобы ткань была хорошо гомогенизирована.
- Нанесите 100 мкл каждого образца (что соответствует 1/5 каждого гомогената, коэффициент разбавления = 5) на агаровые планшеты mDixon и инкубируйте планшеты вверх дном в инкубаторе при температуре 30°C.
заметка: Количество гомогенатного покрытия должно быть скорректировано в соответствии с ожидаемой грибковой нагрузкой. Убедитесь, что на пластине достаточно гомогената, чтобы получить не менее 10 и не более 250 колоний на пластину, чтобы обеспечить легкий подсчет. Опционально можно наложить несколько планшетов на образец с различными разведениями гомогената.
- Регулярно проверяйте рост колоний Malassezia.
заметка: Колонии обычно становятся заметными через 2 - 3 дня. Время, необходимое для роста колоний Malassezia, зависит от вида и штамма Malassezia.
- Посчитайте колонии на тарелке.
- Рассчитайте количество колониеобразующих единиц, КОЕ/г ткани по следующей формуле:
КОЕ/г ткани = (количество колоний/пластинка) x (коэффициент разведения) / (масса образца кожи в г).
заметка: Приблизительный минимальный предел обнаружения можно оценить по следующей формуле: минимальный предел обнаружения = (1 колония/пластина) х (коэффициент разбавления) / (средний вес всех образцов кожи в г).
- Грибковые нагрузки обычно наносятся на график в логарифмической шкале (рисунок 2C).
