Модель полностью дифференцированной макрофагальной инфекции моноцитарных клеток с Mycobacterium tuberculosis

Аннотация

Источник: Mily, A., et al. Поляризация M1 и M2 человеческих моноцитарных клеток и анализ с помощью проточной цитометрии при инфекции Mycobacterium tuberculosis. J. Vis. Exp.(2020).

Это видео демонстрирует метод изучения реакции на инфекцию Mycobacterium tuberculosis в макрофагах, полученных из поляризованных моноцитов человека. Использование проточной цитометрии позволяет изучать различные поверхностные маркеры, связанные с инфицированными и неинфицированными популяциями макрофагов.

Протокол

1. Mtb-инфекция клеток, полученных из моноцитов

ПРИМЕЧАНИЕ: Следующие шаги должны быть выполнены на объекте BSL-3.

1. Ресуспендируйте гранулу Mycobacterium tuberculosis (Mtb) в бессывороточной среде RPMI в новой стерильной пробирке объемом 50 мл и отрегулируйте конечную концентрацию бактерий примерно до 5 x 10⁶ КОЕ/мл.
2. Удалите среду для культивирования клеток из 6-луночного планшета (планшетов), содержащего моноцитарные клетки. Добавьте 1 мл бессывороточной среды RPMI в каждую лунку. Добавьте 1 мл бактериальной суспензии на лунку для получения кратности инфекции (MOI) 5:1, т.е. 5 x 10⁶ КОЕ на 10⁶ макрофагов в 2 мл/лунку и инкубируйте планшеты в течение 4 ч при 37°C и 5%_CO2.
3. После инфицирования промойте клетки 3 раза 1 мл стерильного промывочного буфера для удаления внеклеточных бактерий. Наклоните пластину и осторожно снимите весь буфер для стирки с углов. Ресуспендируйте инфицированные Mtb моноцитарные клетки в 2 мл полной среды RPMI без антибиотиков и приступайте к окрашиванию проточной цитометрией или инкубируйте клетки в течение еще 24 ч (или других временных точек) до проточной цитометрии.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
8-луночные камерные слайды	Лаб-Тек	154534
РПМИ 1640	Корпорация «Лайф Технолоджис»	SH30096.01
ИФН-γ	Пепротех	300-02
На-пируват	GE Здравоохранение Медико-биологические науки	SH300239.01
L-глютамин	GE Здравоохранение Медико-биологические науки	SH30034.01
Falcon 6-луночные пластины с плоским дном	Corning Медико-биологические науки	353046
Фетальная бычья сыворотка (FBS)	Сигма-Олдрич	Ф7524
GM-CSF	Пепротех	300-03