Анализ для изучения роли витронектина в адгезии бактерий к эпителиальным клеткам хозяина

Аннотация

Источник: Singh, B. et al., Анализы для изучения роли витронектина в бактериальной адгезии и резистентности сыворотки. J. Vis. Exp. (2018)

В этом видео мы демонстрируем анализ для изучения роли витронектина в адгезии Haemophilus influenzae к эпителиальным клеткам хозяина.

Протокол

1. Изучение Vn-зависимой адгезии бактерий к эпителиальным клеткам

1. Культивирование клеток A549 (альвеолярные эпителиальные клетки II типа) в колбе для культуры тканей размером^{75 см 2} средой F12 с добавлением 10% (об/об) эмбриональной телячьей сыворотки (FCS) (полная среда) и 5 мкг/мл гентамицина. Инкубируйте колбу в инкубаторе с 5%_CO2 при 37 °C в течение 3 дней до 80% конфлюента (конфлюенцию можно оценить, визуализируя покрытие поверхности клетками с помощью инвертированного микроскопа). Следующие четыре шага описывают, как подготовить эпителиальные клетки к анализу.
   1. Промойте однослойную ячейку в колбе дважды 20 мл PBS путем осторожного взбалтывания. Чтобы отделить клетки от поверхности колбы, добавьте 2 мл раствора фермента для отделения клеток и инкубируйте колбу в течение 5 минут при температуре 37 °C. Постучите по колбе ладонью, чтобы оторвать все клетки от пластиковой поверхности. Проводите пипеткой вверх и вниз несколько раз, чтобы рассеять клеточные комки.
   2. Добавьте в колбу 18 мл полной среды F12 и переложите всю клеточную суспензию в стерильную пробирку Falcon объемом 50 мл. Центрифугируйте клеточную суспензию в течение 5 мин при 200 x g при RT и выбросьте надосадочную жидкость. Ресуспендируйте клеточную гранулу в 10 мл полной среды F12.
   3. Удалите 10 μL клеточной суспензии и поместите ее в пробирку Eppendorf, затем добавьте 90 μL раствора Trypan blue. Загрузите образец в гемоцитометр (глубина 0,1 мм) после установки покровного стекла.
   4. Подсчитайте все жизнеспособные клетки в областях A, B, C и D (каждое поле состоит из 16 квадратов, и каждый квадрат имеет площадь 0,0025 мм²), затем рассчитайте среднее количество клеток ([A+B+C+D]/4). Рассчитайте количество клеток на миллилитр с помощью следующего уравнения:
      Жизнеспособные клетки/мл = среднее количество клеток × 10⁴ × коэффициент разведения.
      заметка: Здесь коэффициент разбавления равен 10.
   5. Клеточную суспензию разбавляют до 5,0 х 10 3 клеток/мл с использованием полной среды, содержащей 5 мкг/мл гентамицина. Дозируйте по 500 мкл клеточной суспензии в каждую лунку 24-луночного планшета для культивирования клеток. Инкубируйте планшет при 37 °C при 5%_CO2 до тех пор, пока клетки не сливаются на 90%.
2. Перед бактериальным заражением извлеките среду из лунок и добавьте среду F12 (без FCS), затем инкубируйте в течение ночи при 37 °C.
3. Промойте монослой ячейки три раза 500 μL PBS при RT. Поместите планшет на лед и добавьте 100 μL предварительно охлажденной среды F12, содержащей 10 μг/мл Vn. Инкубируйте планшет при 4 °C в течение 1 ч. Для контрольных лунок добавляйте только среду F12.
4. После инкубации раствор сбросить с помощью пипетирования и дважды промыть слой клеток 1 мл PBS при РТ.
5. Культуру Hif клинически изолятирует в среду мозговой и сердечной инфузии (BHI) с добавлением 10 мкг/мл NAD и гемина при 37 °C с встряхиванием при 200 об/мин. Используйте среду Лурия-Бертани для культивирования кишечной палочки. Соберите Hif в середине логарифмической фазы (OD600 = 0,3) и ресуспендируйте бактерии в фосфатно-солевом буфере (PBS), pH 7,2, содержащем 1% (w/v) бычьего сывороточного альбумина (BSA) (блокирующий буфер; PBS-BSA). Отрегулируйте подвеску на 10⁹ КОЕ/мл. Ресуспендировать культуру свежевыращенного Hif M10 в среде F12 (2×10⁸ КОЕ/мл). Добавьте по 100 мкл этой бактериальной суспензии в каждую лунку и инкубируйте планшет в течение 2 ч при 37 °C.
   заметка: Каждая лунка содержит примерно 2 x 10⁵ ячеек A549. При инфекции добавляли 2 x 10⁷ бактериальных КОЕ, что соответствует кратности инфекции 100.
6. Удалите среду с помощью пипетирования и трижды промойте эпителиальные клетки А549 PBS. Добавьте 50 μл/лунку раствора для отделения клеток и инкубируйте планшет в течение 5 минут при 37 °C.
7. Затем добавьте 50 мкл полной среды F12 в лунку, чтобы остановить ферментативную реакцию. Перенесите эпителиальные клетки (≈100 мкл [т.е. весь объем]) из каждой лунки в стеклянную пробирку объемом 6 мл, содержащую четыре стеклянных шарика. Лизировать клетки в режиме РТ путем вортексирования в течение 2 мин.
8. Разбавьте 10 мкл клеточного лизата в 100 раз, добавив 10 мкл лизата к 990 мкл среды F12. Выложите 10 мкл разведенного образца на пластину с шоколадным агаром.
9. Инкубируйте тарелку с шоколадным агаром при температуре 37 °C в течение ночи, затем подсчитайте колонии. Каждая колония представляет собой один КОЕ.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Трубка из полистирола с круглым дном 5 мл	BD Falcon	60819-138	12 × стиль 75 мм
Поставляемый инкубатор с 5%CO2	Термо Сайентиал	BBD6220
Трубка из полистирола с круглым дном 6 мл	ВВР	89000-478	12 × модели 75 мм с колпачком
24-луночные планшеты	BD Falcon	08-772-1H (на английском языке)	Сорт клеточной культуры
75 см2 колба для культуры тканей	BD Falcon	BD353136	Вентилируемые
A549 Клеточная линия человека	Сигма-Олдрич	86012804-1ВЛ
Фермент отслоения клеток (Аккутаза)	Сигма-Олдрич	А6964-500МЛ	Сорт клеточной культуры
Бычьи сывороточные альбумины (BSA)	Сигма-Олдрич	А2058	Подходит для культивирования клеток
F12 средний	Сигма-Олдрич	Д6421	Сорт клеточной культуры
Фетальная сыворотка теленка (FCS)	Сигма-Олдрич	12003С	Подходит для культивирования клеток
Гемоцитометр	Мариенфельд	Номер 640210
Колба для культуры тканей	BD Falcon	3175167	75 см2
Витронектин (Vn) из плазмы крови человека	Сигма-Олдрич	В8379-50УГ	Сорт клеточной культуры