Методическая статья

Определение роли витронектина в устойчивости бактерий к бактерицидной активности сыворотки крови человека

8 июля 2025 г.

В этой статье

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Источник: Singh, B. et al., Анализы для изучения роли витронектина в бактериальной адгезии и резистентности сыворотки.J. Vis. Exp.(2018)

Это видео демонстрирует роль витронектина, гликопротеина сыворотки крови человека, на устойчивость бактерий. Антитела в сыворотке крови взаимодействуют с бактериальными поверхностными белками, активируя белки комплемента и образуя комплекс мембранной атаки, вызывая лизис бактериальных клеток. Связывание витронектина с бактериальным мембранным белком предотвращает образование комплекса мембранной атаки, что приводит к выживанию бактерий.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Все процедуры, связанные со сбором образцов, были выполнены в соответствии с рекомендациями института IRB.

1. Анализ Vn-зависимой резистентности к бактерицидной активности сыворотки крови человека

  1. Приобретайте нормальную человеческую сыворотку (NHS) из коммерческого источника. Приготовьте витронектин или Vn-истощенную сыворотку (VDS). Пополните VDS 180 нМ Vn, что эквивалентно Vn, присутствующему в NHS.
  2. Приготовьте термоинактивированную сыворотку (ГИС) путем нагревания NHS до 56 °C в течение 30 минут с целью инактивации белков комплемента.
    заметка: Оптимальную концентрацию в сыворотке крови (5%) и время инкубации (15 мин) для анализа определяли опытным путем для Haemophilus influenzae типа f (Hif); Эти параметры могут варьироваться для других бактериальных патогенов.
  3. Культивирование бактерий (в данном случае Hif M10 и мутантного Hif M10Δlph) до среднелогарифмической фазы (OD600 = 0,3). Гранулирование бактерий центрифугированием при давлении 3 500 x g в течение 10 минут.
  4. Ресуспендируйте бактериальную гранулу 1 объемом декстрозного желатинового буфера Veronal (DGVB++; pH 7,3), содержащего 2,5% (w/v) глюкозы, 2 мМ хлорида магния, MgCl2, 0,15 мМ хлорида кальция, CaCl2 и 0,1% (масс./об.) желатина.
  5. Добавьте 1,5 x 103 колониеобразующие единицы (КОЕ) бактерий к 100 мкл DGVB++, содержащего 5% сыворотки (NHS, HIS, VDS или VDS+180 нМ Vn). Образец инкубировать при 37 °C в течение 15 мин с встряхиванием при 300 об/мин.
  6. Удалите аликвоту объемом 10 мкл из реакционной смеси через 0 мин (образец T0) и 15 мин (образец Tt) и положите на тарелку шоколадный агар. Инкубируйте тарелку при температуре 37 °C в течение ночи.
  7. После инкубации подсчитайте колонии, появившиеся на тарелке. Рассчитайте процент уничтоженных бактерий с помощью следующего уравнения: (колониеобразующая единица или КОЕ при Tt)/(КОЕ при T0) × 100.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
Конфликт интересов не декларируется.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Трубка из полистирола с круглым дном 6 мл ВВР89000-47812 × модели 75 мм с колпачком
Нормальная сыворотка крови человека (NHS)Комплемент Технолоджи, Инк.Национальная служба здравоохранения (NHS)Объединенная человеческая сыворотка
Хлорид кальция (CaCl2)Сигма-ОлдричС5670-500Г
глюкозаСигма-ОлдричГ8270-1КГ
желатинСигма-ОлдричГ9391Подходит для культивирования клеток
ГемоцитометрМариенфельдНомер 640210
Хлорид магния (MgCl2)Сигма-ОлдричМ8266-1КГ
Витронектин (Vn) из плазмы крови человекаСигма-ОлдричВ8379-50УГСорт клеточной культуры
шейкер Стюарт СайентификСТР6Встряхиватель платформы

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

DGVB

Похожие статьи