Модель инфекции слизистой оболочки шейки матки человека для изучения патогенеза ВИЧ в условиях ex vivo

Аннотация

Источник: Introini, A., et al., ex vivo Инфекция лимфоидной ткани человека и слизистой оболочки женских половых органов вирусом иммунодефицита человека 1 и гистокультура. J. Vis. Exp. (2018).

Это видео демонстрирует ex vivo инфицирование слизистой оболочки матки человека вирусом иммунодефицита человека типа 1, HIV-1, и их содержание на желатиновых губках на границе между воздухом и жидкостью. Этот метод позволяет проводить мониторинг репликации и патогенеза ВИЧ-1 в тканях человека.

Протокол

Все процедуры с участием людей были выполнены в соответствии с институциональными, национальными и международными рекомендациями по благополучию человека и были рассмотрены местным институциональным наблюдательным советом.

1. Рассечение и инфекция слизистой оболочки шейки матки

ПРИМЕЧАНИЕ: Для достижения оптимальных результатов, экспланты слизистых оболочек шейки матки должны быть обработаны и инфицированы как можно скорее после операции, в идеале в тот же день операции. В качестве альтернативы образцы могут храниться в условиях погружения в CMT (питательные среды с добавлением антибиотиков) при температуре 4°C в течение ночи и инфицироваться сразу после вскрытия.

1. Дайте КМ достаточно времени, чтобы достичь РТ, или поместите его на водяную баню, предварительно нагретую до 37°C. Перед использованием дополните КМ раствором антибиотика (СМТ). Выбросьте остатки раствора антибиотика. Налейте 70% раствор этанола в чистую емкость, чтобы замочить щипцы и скальпель при необходимости во время процедуры вскрытия. Очистите инструменты и замените лезвие скальпеля между вскрытиями образцов от нескольких доноров.
2. С помощью стерильных щипцов перенесите образец из транспортировочного контейнера в чашку Петри диаметром 100 мм, содержащую 10–20 мл ШМТ.
3. Используйте крышку чашки Петри в качестве режущей поверхности для рассечения ткани. Аккуратно удерживая ткань щипцами, отделите слизистую оболочку эктоцервикса и/или эндоцервикса от нижней стромальной и мышечной ткани (подслизистой оболочки) с помощью скальпеля и лезвия для получения полосок слизистой оболочки.
   заметка: При работе с одним кусочком ткани важно держать остальную ткань погруженной в среду, чтобы избежать высыхания тканей.
4. Разрежьте слизистую оболочку на полоски шириной 2 мм, удалите и выбросьте как можно больше подслизистой оболочки, оставив только слой ткани толщиной 2 мм. Нарежьте полоски на блоки толщиной 2 мм. Это должно привести к тканевым эксплантам размером примерно 8 мм³,<бр/> Внимание: Работа с острыми инструментами для препарирования человеческих образцов увеличивает риск травм и загрязнения. Оператор должен подумать о ношении металлических, сетчатых и устойчивых к порезам перчаток в качестве дополнительной защиты.
5. Перенесите тканевые экспланты в новую чашку Петри диаметром 100 мм, содержащую 10–20 мл ШМТ, чтобы избежать высыхания тканей во время диссекции. В конце вскрытия поверните пластину, чтобы рандомизировать распределение экспланта.
6. С помощью стерильных щипцов перенесите экспланты в стерильные конические пробирки объемом 1,5 мл (максимум 16 эксплантов на пробирку). Удалите всю среду из пробирки с помощью пипетки.
7. Разморозьте препарат ВИЧ-1 на водяной бане при температуре 37 °С. При необходимости разбавьте вирусный запас CM. Перенесите вирус в пробирку (пробирки), содержащие экспланты. Выбросьте все остатки вирусного препарата.
   заметка: Вирусный запас следует разбавлять таким образом, чтобы выбранный посевной материал содержался в объеме не менее 0,5 мл (табл. 1). Чтобы уменьшить вариабельность результатов между независимыми экспериментами, один и тот же вирусный препарат следует использовать для всего исследования (Таблица материалов).
8. Переложите пробирки в термошейкер и инкубируйте в течение 2 ч при 37°C, покачивая при 300 об/мин. Осторожно переворачивайте трубки несколько раз каждые 30–60 мин.<бр/> Примечание: Для эффективной инфекции крайне важно использовать минимальное время, необходимое между размораживанием препарата ВИЧ-1 и переносом пробирок до 37 °C.
9. Заполните 6-луночный планшет 3–4 мл стерильного фосфатного буферного раствора (PBS) на лунку. В конце инкубации с ВИЧ-1 сбросить весь вирусный препарат из пробирки (пробирок) в емкость с дезинфицирующим раствором с помощью пипетки. Перенесите экспланты в 6-луночный планшет, содержащий PBS, с помощью щипцов.
10. Дайте эксплантам отдохнуть в PBS в течение 1 минуты при ртутной терапии, а затем промойте их, аккуратно проводя пипетированием вверх и вниз PBS в лунку 2-3 раза. Слейте PBS в емкость с дезинфицирующим раствором с помощью пипетки. Добавьте в каждую лунку по 3–4 мл нового PBS. Повторите еще два раза, всего три стирки. Выбросьте PBS непосредственно перед переносом эксплантов на губки, чтобы избежать высыхания тканей.
    заметка: Экспланты слизистой оболочки шейки матки, и в частности эндоцервикса, выделяют большое количество слизи во время инфекции. Крайне важно промыть и удалить как можно больше слизи, потому что неспецифическая задержка на эксплантах и последующий выброс вируса в надосадочную жидкость культуры могут замаскировать репликацию вируса.
11. С помощью щипцов перенесите 5-8 эксплантов поверх каждой желатиновой губки в 12-луночную пластину. Верните тарелку в инкубатор.
12. Утилизировать все биологические отходы в противоположные контейнеры в соответствии с установленными институтом правилами обращения с опасными биологическими препаратами и специальной оценкой рисков.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Gelfoam 12-7 мм Абсорбируемый желатиновый бисквит	Компания Pfizer	НДЦ: 0009-0315-08	Гельфоам и Спонгостин одинаково хорошо проявляют себя в гистокутуре как для миндалин, так и для цервикальной ткани.
SPONGOSTAN Standard 70 × 50 × 10 мм Губка желатиновая рассасывающаяся гемостатическая	Медицинские приборы Ferrosan	МС0002	Гельфоам и Спонгостин одинаково хорошо проявляют себя в гистокутуре как для миндалин, так и для цервикальной ткани.
RPMI 1640 с феноловым красным и глютамином	ThermoFisher Scientific	21875034	Для RPMI1640 добавьте заменимые аминокислоты MEM, пируват натрия, гентамицин, амфотерицин B и FBS 15% (v/v) для получения питательной среды (CM).
Стерильный фосфатно-солевой буфер (PBS) pH 7,4 без кальция, магния и фенола красного			Использовать для хранения и транспортировки хирургических препаратов. PBS может быть заменен другим изотоническим раствором с физиологическим pH. Питательная среда лучше всего подходит для хранения на ночь.
Стерильная вода для клеточных культур
70% раствор этанола
Дезинфицирующий раствор для утилизации биологических отходов
Стерильные металлические щипцы или пинцет
Стерильные металлические ножницы
Стерильный плоский весовой металлический шпатель
Стерильные скальпели и лезвия
6-луночные планшеты для культивирования клеток
Стерильная чашка Петри, 100 мм × 20 мм
Бесклеточный вирусный препарат HIV-1BaL	Программа реагентов NIH для СПИДа	510	Вирус следует размножить, чтобы создать поголовье, достаточное для проведения нескольких экспериментов. Вирус Алиquote суспензию и хранить при температуре -80 °C. Избегать многократного замораживания и размораживания.
Бесклеточный вирусный препарат HIV-1 HIV-1LAI.04	Программа реагентов NIH для СПИДа	2522	Вирус следует размножить, чтобы создать поголовье, достаточное для проведения нескольких экспериментов. Вирус Алиquote суспензию и хранить при температуре -80 °C. Избегать многократного замораживания и размораживания.
Стерильные пробирки с завинчивающейся крышкой объемом 1,5 и 2 мл
Водяная баня при температуре 37 °C
Шкаф биологической безопасности
Шейкер для сухой ванны с нагревательным блоком для трубок объемом 1,5 мл, установленный на 37 °C, 300 об/мин

г.