$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Измерение биоактивного ИФН I типа с использованием репортерных клеток HEK-Blue IFN-α/β.
Примечание: Эти клетки были получены путем стабильной трансфекции клеток HEK293 с человеческими генами STAT2 и IRF9 для получения полностью активного сигнального пути ИФН I типа. Они также содержат секретируемый репортерный ген щелочной фосфатазы (SEAP) под контролем индуцируемого промотора ISG54 ИФН-α/β. Стимуляция этих клеток ИФН I типа активирует путь JAK/STAT/ISGF3 и индуцирует выработку SEAP.
- Поддерживайте клетки HEK-Blue IFN-α/β в DMEM с добавлением 10% FBS. Наложите их с плотностью 50 000 ячеек на лунку в 96-луночный планшет с плоским дном и конечным объемом 180 мкл.
- Смешайте 220 мкл PBMC (разбавленных до 850 000 клеток/мл) или 220 μл плазмоцитоидных дендритных клеток (pDCs) (в концентрации от 100 000 до 500 000 клеток/мл) с 30 μл инфицированных Т-клеток (разведенных при концентрации 106 клеток/мл) на лунку в 96-луночном планшете с U-образным дном.
- Инкубируйте сокультуры при 37 °C и 5%CO2 в течение 18-22 часов, а затем перенесите их в 96-луночный планшет с V-образным дном. Центрифуга в течение 5 минут при 400 x g.
- Добавьте по 20 мкл надосадочной жидкости в каждую лунку в двух экземплярах. Каждый планшет также требует набора внутренних стандартных средств контроля (человеческий ИФНα, конечная концентрация от 100 Ед/мл до 2500 Ед/мл). Инкубируйте планшеты при 37 °C и 5%CO2 в течение 18-22 часов.
- Определите уровни активности щелочной фосфатазы с помощью раствора QUANTI-Blue, который изменяется от розового до фиолетового/синего в присутствии фермента. Приготовьте QUANTI-Blue в соответствии с рекомендациями производителя. Добавьте по 180 мкл этого раствора в каждую лунку 96-луночного планшета с плоским дном. В каждую лунку также добавляют 20 мкл индуцированного надосадочной жидкости HEK-Blue IFN-α/β клеток и инкубируют планшет в инкубаторе при температуре 37 °C до тех пор, пока в стандартных контрольных лунках ИФН не проявится цвет.
- Оцените уровни SEAP с помощью спектрофотометра на длине волны 620-655 нм и определите концентрацию ИФН I типа путем экстраполяции из линейной части стандартной кривой ИФН.