Метод генерации вирусоподобных частиц гриппа с помощью системы млекопитающих

Аннотация

Источник: Arevalo, M. T., et al.Экспрессия и очистка вирусоподобных частиц для вакцинации. J. Vis. Exp. (2016).

Это видео демонстрирует генерацию вирусоподобных частиц гриппа (VLP) в организме млекопитающих. После экспрессии трех эукариотических векторов экспрессии, кодирующих различные вирусные структурные белки, в подходящих клетках-хозяевах млекопитающих, экспрессированные вирусные белки самоорганизуются в VLP на плазматической мембране хозяина и высвобождаются путем отпочковывания с поверхности клетки.

Протокол

1. Система экспрессии вируса гриппа H3N2 VLP у млекопитающих

1. Субклонируйте вирусные структурные гликопротеины гемагглютинин (HA), нейраминидазу (NA) и вирус иммунодефицита человека (ВИЧ) Gag (групповой специфический антиген) p55 в эукариотические векторы экспрессии, такие как ранее описанный pTR600.
2. Амплифицируйте ДНК химически компетентных кишечных палочек (например, DH5α) и изолируйте плазмиды трансфекционного качества с помощью набора для очистки плазмид в соответствии с инструкциями производителя. Количество ДНК зависит от выхода и потребностей пользователя.
3. Поддерживайте клеточную линию млекопитающих, 293T, в питательной среде, содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS), при температуре 37 °C с 5%_CO2 в увлажненном инкубаторе.
4. Выращивайте клетки таким образом, чтобы колба для культуры тканей Т-150 содержала 45-75 x^10-6 клеток в колбе таким образом, чтобы колба достигала полной клеточной адгезии и 85-95% слияния клеток к следующему дню. Осмотрите клетки под микроскопом на предмет желаемого слияния.
   заметка: Высокая плотность клеток обычно рекомендуется для получения оптимальной экспрессии белка с минимальной цитотоксичностью при использовании коммерческих реагентов для трансфекции, однако чрезмерное слияние может привести к накоплению побочных продуктов клеточных отходов и снижению жизнеспособности клеток.
5. В день трансфекции готовят смесь липосом и ДНК в соответствии с рекомендациями производителя и трансфицируют клетки ДНК с составом ДНК 1:1:2 HA:NA:Gag с общим количеством ДНК 40 мкг на колбу Т-150. Развести растворы ДНК и липосом в бессывороточных трансфекционных средах без антибиотиков так, чтобы в каждой колбе содержался общий объем 20-30 мл.<бр/> заметка: Соотношение генных конструкций может потребовать пользовательской оптимизации. Хотя здесь это не продемонстрировано, аналогичная процедура трансфекции была выполнена с респираторно-синцитиальным вирусом (РСВ) F и ВИЧ Gag в соотношении 1:1. Для плазмид одиночной экспрессии DENV и CHIKV для оптимальной экспрессии используется в общей сложности 20 мкг ДНК на колбу T-150. Соотношение ДНК:трансфекционный реагент оптимизировано для пользователя. Используйте рекомендуемую трансфекционную среду на основе метода трансфекции, т.е. поликатионные липидные трансфекции рекомендуют уменьшение или отсутствие фетальной бычьей сыворотки, таким образом, среда может быть дополнена гормонами роста и микроэлементами для поддержки роста в отсутствие сыворотки.
6. Верните колбы до 37 °C с 5%_CO2 в инкубаторе. Для объема 200 мл используйте 9 колб Т-150. Клетки выдерживают в трансфекционной питательной среде до дня забора VLP.
7. Супернатант культуры извлекают из клеток через 72-96 ч после трансфекции в зависимости от антигена или когда жизнеспособность клеток снизилась до 70-80% по оценке микроскопического исследования. Перелейте надосадочную жидкость в конические пробирки объемом 50 мл и опустите клетки при 500 × г в течение 5 минут при 4 °C для гранулирования клеточного мусора.
   Примечание: Замена 3-дневного надосадочной жидкости на свежую предварительно подогретую среду для трансфекции адгезивных клеток без сыворотки приведет к получению второй партии VLP с аналогичным или немного меньшим выходом и должна быть оптимизирована пользователем.
8. Выделите надосадочную жидкость для бассейна и профильтруйте через поровую мембрану размером 0,22 мкм перед осаждением с помощью ультрацентрифугирования.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Набор Plasmid Maxi	Цягэн	12163
DMEM	Селлгро	10-013
Липофектамин	Технологии Life	L3000075	Липофектамин 2000, Липофектамин 3000
Opti-MEM I	Технологии Life	31985062
Многоточечная мешалка Cimarec I 6	ThermoFisher Scientific	50094596
Ультрацентрифужные пробирки Polyclear	Сетон	7025
Верхняя часть вакуумного фильтра 0,22 мкм (500 мл)	Налген	569-0020
глицерин	сигма	Г5516