Генерация вирусоподобных частиц чикунгунья с использованием системы экспрессии бакуловируса в клетках насекомых

Аннотация

Источник: Arevalo, M. T. et al., Экспрессия и очистка вирусоподобных частиц для вакцинации.J. Vis. Exp. (2016)

Это видео показывает, как вирусоподобные частицы, VLP образуются путем заражения клеток насекомых рекомбинантным бакуловирусом, несущим кассету с генами вируса чикунгунья. Рекомбинантный вирус инфицирует клетки, что приводит к образованию, сборке и высвобождению VLP в культуральную среду для потенциального использования в производстве вакцин.

Протокол

1. Экспрессия вирусоподобных частиц (VLP) Чикунгуньи с использованием системы клеток бакуловируса/насекомых

1. Получение рекомбинантного бакуловируса, экспрессирующего капсид и оболочечные белки вируса чикунгунья (C-E3-E2-6K-E1) из штамма S-27 с использованием коммерческой системы экспрессии бакуловируса.
2. Культивируйте клетки Spodoptera frugiperda Sf9 в бессывороточной питательной среде Sf9 со 100 Ед/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина при 28 °C. Используйте 3-5 x 10⁵ ц/мл для инициации культур колб спиннера для роста суспензионных клеток. Пассаж обычно при достижении плотности клеток 2-4 x 10⁶ ц/мл (каждые 3-4 дня).
3. Культивирование клеток Sf9 в суспензии в колбах-спиннерах с перемешиванием при 130 об/мин на многоточечной пластинчатой мешалке. Для правильной аэрации поддерживайте объемы культивирования на уровне не более половины объема колбы спиннера.
4. Для экспрессии Chikungunya или CHIK VLP инфицируют клетки Sf9 с плотностью 2 x 10⁶ клеток/мл рекомбинантным бакуловирусом при кратности инфекции 1 и возвращают в инкубатор при температуре 28 °C. Как правило, заражают одну или две колбы, содержащие 250 мл Sf9 клеток.
   заметка: Хотя мы не используем этот метод, клетки Sf9 можно культивировать в колбах-шейкерах при температуре 28 °C с использованием шейкерной платформы.
5. Собирайте культуру через 72-96 часов после заражения или когда жизнеспособность клеток снизилась до 70-80% в соответствии с протоколом производителя Trypan Blue Exclusion.
   заметка: Клетки продолжают пролиферировать во время инфицирования, и существует ~80% жизнеспособности в культурах Sf9, инфицированных рекомбинантным бакуловирусом CHIK VLP через 3 дня после заражения (dpi). Клетки, инфицированные бакуловирусом, имеют более крупный внешний вид. Морфология также может меняться от круглой до продолговатой. На поздних стадиях бакуловирусных инфекций клетки начинают лизироваться.
6. Перенесите культуры непосредственно из суспензионной культуры в конические пробирки объемом 50 мл и вращайте клетки при 500 x g в течение 5 минут при 4 °C.
7. Соберите надосадочную жидкость и профильтруйте через поровую мембрану размером 0,22 мкм перед осаждением с помощью ультрацентрифугирования.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Opti-MEM I	Технологии Life	31985062
Система экспрессии бакуловируса Bac-to-Bac	Технологии Life	10359-016
Верхняя часть вакуумного фильтра 0,22 мкм (500 мл)	Налген	569-0020
Sf-900 II SFM	ThermoFisher Scientific	10902-096 (Английский)
Многоточечная мешалка Cimarec I 6	ThermoFisher Scientific	50094596