Все процедуры, связанные с животными, были проверены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом JoVE.
1. Обращение с животными, подготовка и индукция воспаления
- Используйте мышей в возрасте 4 - 6 недель с весом 16 - 20 г. Примечание: Если мыши старше или тяжелее, у них наблюдается чрезмерное количество жира вокруг сосуда, что ограничивает микроскопическое наблюдение.
- Стерилизуйте все инструменты и стол с микроскопом перед операцией.
- Введите 20 мг/кг ЛПС (липополисахарид) внутрибрюшинно за 4 часа до микроскопии живой мыши, чтобы вызвать бактериальное воспаление.
- Предварительно подогрейте 0,9% солевой раствор на водяной бане при температуре 37 °C, чтобы увлажнить пластиковую камеру и ткань брыжейки.
- Анестезируйте мышь с помощью внутрибрюшинной инъекции кетамина (100 мг/кг) и ксилазина (5 мг/кг) непосредственно перед процедурой микроскопии. Может быть использована альтернативная анестезия, например, ингаляция с 2% изофлураном. Подтвердите правильную анестезию потерей реакции на рефлекторную стимуляцию (щипом пальца ноги или хвоста с сильным нажимом).
- Депилируйте живот с помощью бритвы и удалите выпавшие волосы марлей, насыщенной этанолом на 70%.
- Нанесите ветеринарную мазь на глаза мыши, чтобы предотвратить сухость, находясь под наркозом.
2. Хирургия
- Простерилизуйте брюшную полость, используя 70% этанол. Этот метод не является стерильным и может привести к летальному исходу в конце эксперимента.
- Выполните срединную лапаротомию: откройте кожу живота с помощью небольших изогнутых щипцов и маленьких ножниц. Определите эпигастральные сосуды и вскройте брюшину в области белой линии, чтобы защитить сосуды.
- Нанесите несколько капель предварительно подогретого солевого раствора в брюшную полость, чтобы сохранить ткани влажными.
- Флуоресцентное мечение лейкоцитов и тромбоцитов путем инъекции 50 мкл родамина 6G (1 мг/мл) ретроорбитально.
- Вынесите петлю подвздошной кишки и поместите ее в чашку Петри диаметром 10 см; следите за тем, чтобы ткань оставалась влажной, применяя предварительно подогретый физиологический раствор с температурой 37 °C (0,9%) каждые две минуты.
3. Прижизненная микроскопия
- Поместите мышь под микроскоп и окажите в центре зрения вену брыжейки диаметром 200 - 300 мкм. Выбирайте сосуд без видимого жирового окружения.
- Не прикасайтесь к сосудам брыжейки, тем самым избегая стимуляции эндотелия. Обращайтесь с петлей подвздошной кишки осторожно.
- Визуализируйте взаимодействие клеток крови с эндотелием с помощью перевернутого или вертикального микроскопа и камеры с помощью программного обеспечения для микроскопа. Запишите взаимодействие клеток крови с эндотелием в течение 1 минуты в 4 различных венах каждой мыши.
- Усыпьте мышь при вывихе шейки матки после завершения экспериментов с визуализацией.
4. Анализ
- Проводите анализ в автономном режиме и вслепую по всем параметрам. Проведите анализ с помощью любой подходящей программы.
- Подтвердите стабильные и межиндивидуальные сопоставимые условия кровотока в киноклипах с высоким временным разрешением (максимальная частота кадров), сфокусированных на внутрипросветном потоке клеток крови.
- Количественно определите количество прокатывающихся лейкоцитов. Поэтому проведите вертикальную линию через вену и посчитайте все лейкоциты, пересекающие эту линию за 1 минуту.
- Определите скорость качения, измерив время, за которое один лейкоцит должен пройти расстояние 50 мкм при стабильном прокате по эндотелию. Для этого нужно провести через жилку две вертикальные линии на расстоянии 50 мкм.
- Измерьте время, за которое репрезентативный лейкоцит должен пройти от одной линии до другой. Рассчитайте скорость лейкоцитов, разделив 50 мкм на необходимое время (мкм/с).
- Измерьте адгезию лейкоцитов в поле 0,04 мм2. Для этого в жилку втягиваем квадрат со стороной 200 мкм.
- Подсчитайте твердые адгезивные лейкоциты, определенные как отсутствие видимого движения в течение 30 секунд, в пределах этого квадрата.
- Подсчитайте количество тромбоцитов, связанных с одним лейкоцитом, чтобы количественно оценить тромбоцитарно-лейкоцитарные взаимодействия.
