Подкожное введение бактериального антигена для индукции системного воспаления на мышиной модели

Аннотация

Источник: John, S. et al., Primed Mycobacterial Uveitis (PMU) как модель постинфекционного увеита.J. Vis. Exp. (2021)

Это видео демонстрирует индукцию системного воспаления у мыши, находящейся под наркозом. Введение депо микобактериального антиген-адъюванта запускает высвобождение цитокинов и локализованное воспаление. Лимфатические сосуды открываются, что позволяет иммунным клеткам проникать в лимфатические узлы и активировать Т-клетки, которые высвобождают провоспалительные цитокины, что приводит к широкому распространению воспаления.

Протокол

Все процедуры, связанные с животными, были проверены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом JoVE.

1. Препарат антигена для подкожного введения

1. Выполняйте все процедуры в этом разделе внутри вытяжного шкафа для химических веществ, чтобы предотвратить вдыхание или контакт кожи с порошком Mycobacterium tuberculosis, Mtb H37Ra. Обращайтесь в соответствии с политикой вашего учреждения для полного адъюванта Фрейнда (обычно BSL-1). Это включает в себя использование химически стойких перчаток, защитных очков и защитной рабочей одежды (лабораторного халата).
2. Используйте хорошую стерильную технику, чтобы предотвратить загрязнение реагентами, которые будут вводиться подопытным животным.
3. Приготовьте суспензию Mtb в фосфатно-солевом буфере (PBS), смешав 5 мг лиофилизированного, убитого при нагревании порошка Mycobacterium tuberculosis H37Ra с 2,5 мл холодного PBS в микроцентрифужной пробирке объемом 5 мл. Сделайте вихрь один раз на 30 секунд и затем поместите на лед.
4. Чтобы получить тонкую суспензию H37Ra в PBS, ультразвуком обрабатывайте суспензию на льду в течение 5 минут.
   1. Разжмите корпус блока преобразователя и очистите щуп 70% спиртовым тампоном.
   2. Включите ультразвуковую аппарат, установите мощность на 4, повернув ручку регулировки питания, и погрузите наконечник зонда в порошок микобактерий, содержащий PBS. Убедитесь, что наконечник зонда погружен по крайней мере на половину глубины образца и что наконечник зонда не касается стенки микроцентрифужной пробирки.
5. Обрабатывайте смесь ультразвуком на льду в течение 30 секунд, сделайте паузу в течение 30 секунд и повторяйте в общей сложности 5 минут, чтобы полностью диспергировать порошок в однородную суспензию без нагрева жидкости.
6. Добавьте в смесь 2,5 мл неполного адъюванта Фройнда и повторяйте процесс ультразвука на льду до тех пор, пока эмульсия не образует консистенцию, похожую на зубную пасту.
7. Установите мощность на 0 с помощью ручки управления и выключите устройство, чтобы завершить ультразвуковую обработку. Снимите наконечник с суспензии и протрите щуп спиртовым тампоном.
8. Храните антигенную эмульсию при температуре 4 °C. Приготовление партий эмульсии поможет обеспечить согласованность между экспериментами. Эмульсия может храниться при температуре 4 °C до 3 месяцев.

2. Подкожная инъекция

1. Выполните подкожную инъекцию за неделю до интравитреальной инъекции (обозначается как день -7).
2. Загрузите микобактериальную эмульсию в шприц объемом 1 мл (без иглы). Из-за вязкости и непрозрачности эмульсии трудно различимые пузырьки воздуха могут заполнять шприц.
   1. Чтобы предотвратить образование пузырьков воздуха в шприце, после загрузки 0,2-0,3 мл эмульсии переверните шприц кончиком вверх и осторожно постучите шприцем несколько раз по краю прилавка, чтобы вывести пузырьки на поверхность.
3. Выдавите воздух из шприца и продолжайте наполнять шприц. Переверните и периодически постукивайте до полного заполнения.
4. Поместите иглу 25 г на шприц и направьте эмульсию до заполнения иглы. Храните шприц на льду до использования.
5. Чтобы безопасно выполнить подкожную инъекцию, либо обезболите мышь, либо используйте гуманные методы сдерживания, которые обеспечивают легкий доступ к задним конечностям животного.
6. Для обезболивания для подкожного введения поместите животное в индукционную камеру изофлурана (3%-4% для индукции и 1%-3% для поддержания). После обезболивания убедитесь, что у мыши медленный темп дыхания и нет признаков респираторного дистресса.
7. Подкожные инъекции следует делать либо на тыльную поверхность бедер, либо на вентральную поверхность ног, расположенную проксимальнее области паховых лимфатических узлов.
   1. Осторожно введите иглу, чтобы предотвратить инъекцию в мышцу. Введите 0,05 мл эмульсии Mtb в подкожное пространство. Не удаляйте иглу сразу, чтобы дать возможность полностью впрыснуть густую эмульсию.
   2. Повторите инъекцию с левой и правой стороны в общей сложности 0,1 мл на животное.
8. Если мышь находится под наркозом, положите ее на теплую грелку до полного выздоровления. Не оставляйте мышь без присмотра до тех пор, пока она не придет в сознание, достаточное для поддержания лежачего положения на грудине.
9. После полного выздоровления верните мышь в клетку и пометьте карту клетки датой подкожной инъекции.
10. Обеспечьте обезболивание пероральным ацетаминофеном (200 мг/кг/сут), но не нестероидными противовоспалительными препаратами (НПВП), так как противовоспалительные средства могут влиять на индукцию увеита.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Неполный адъювант Фройнда	BD Difco, Нью-Джерси, США	No 263910
Экстракт лиофилизированных микобактерий H37Ra	BD Difco, Нью-Джерси, США	231141
Игла для инсулина	Exel International, США	No 26029	1 мл
Изофлуран
ПБС	Gibco	14190
RM2255	Leica Biosystems, Иллинойс, США		Секционирование тканей
Шприц для туберкулеза	Becton, Dickinson and Company, Нью-Джерси, США	309602	1 мл
Тайленол	Johnson & Johnson Consumer Inc, Пенсильвания, США	НДЦ 50580-614-01	Ацетаминофен